基于網絡藥理學探討氣血雙補方抗慢性心力衰竭的作用機制*

林 鑫，劉 陽，陳林偉，薛一濤△

1 山東中醫藥大學附屬醫院,山東 濟南 250014；2 南京中醫藥大學泰州附屬醫院

氣血雙補方是著名中醫學家孟景春教授的臨床經驗方[1-5］，該方由人參、炙黃芪、酒當歸、酒炒白芍、陳皮、玉竹、酒黃精、制首烏、枸杞子等9 味中藥組成，具有補益氣血、通陽散結、活血通絡、復脈固脫等功效，主要用于治療慢性心力衰竭疾病[6］。但是對氣血雙補方的研究仍然存在以下問題：氣血雙補方抗慢性心力衰竭作用的物質基礎及其作用機理尚未闡明，預測氣血雙補方的相關作用機制依然十分困難。而組學結合網絡藥理學的研究方法為解決這一難題提供了新的研究思路[7-9］。因此，本研究采用網絡藥理學的研究思路對氣血雙補方抗慢性心力衰竭的作用機制進行研究，構建“單味藥-活性成分-作用靶點”網絡，為深入探討其作用機制和藥效物質基礎提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源本研究采用中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），以人參、黃芪、當歸、白芍、陳皮、玉竹、黃精、何首烏、枸杞子為關鍵詞，搜索氣血雙補方中9味中藥的全部化學成分。

1.2 活性化合物篩選本研究以化合物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為活性化合物的篩選條件，篩選出TCMSP中具有較高活性的化合物。

1.3 化合物-靶點網絡的構建通過TCMSP 平臺尋找與候選化合物相關的潛在靶點，將候選化合物與其潛在的靶點蛋白上傳至CytoSpace 3.7.0軟件（http：//www.cytoscape.org）生成體現藥物-靶點相互作用的網絡圖，以探討氣血雙補方的藥理學作用機制。

1.4 疾病靶點的確定搜索TTD 數據庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）、STRING 數 據庫（https：//string-db.org/）以及UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/），共搜索到與慢性心力衰竭相關的靶點302個。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建為了說明靶點蛋白在系統水平上的作用，利用CytoSpace 3.7.0軟件中的Bisogenet插件，分別構建成分靶點PPI和疾病靶點PPI，對二者進行拓撲分析并篩選核心靶點。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析本研究利用CytoSpace 3.7.0軟件對PPI網絡中篩選出的核心靶點蛋白進行GO功能富集分析。

1.7 基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析利用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對PPI網絡中的蛋白進行KEGG通路富集分析，說明中藥化合物的靶點蛋白在信號通路中的作用，得到氣血雙補方抗慢性心力衰竭中的主要作用通路，并通過Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/）對富集分析結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選通過TCMSP 共收集到氣血雙補方中化合物共850個，其中來自人參190個，黃芪87個，當歸125個，白芍85個，陳皮63個，玉竹62 個，黃精38 個，何首烏12 個，來自枸杞子188 個。以OB≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，化合物分子中有128 個符合條件，經去除重復值得到107個化合物，將其作為候選化合物。

2.2 氣血雙補方化合物-靶點相互作用網絡利用CytoSpace 3.7.0 軟件將107 個化合物與靶點構建化合物-靶點網絡，化合物-靶點網絡總共包括284 個節點（104 個化合物節點和177 個靶點節點），1532 條邊。107 個化合物中有3 個化合物在數據庫中未找到相關靶點，未參與網絡構建。在網絡中，一個節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連接的路線條數。在該網絡中，每個化合物的平均靶點數目為14.7個，每個靶點平均與8.66個化合物相互作用。在化合物方面，有32 個化合物的作用靶點≥20個，其中靶點≥35個的化合物有9 個。度排名前三的是Mol000098（quercetin）、Mol000422（kaempferol）、Mol000378（7-O-methylisomucronulatol）。在177個潛在靶點中，有114個靶點與3 個以上化合物連接，說明大多數蛋白質都與其他蛋白享有共同的配體。這體現了氣血雙補方多成分與多靶點之間共同作用的機制，符合中藥復方的特點。見圖1。

2.3 PPI 網絡的構建與分析利用CytoSpace 3.7.0 軟件中的Bisogenet 插件，分別構建化合物潛在靶點PPI（727個節點13328條邊）和慢性心力衰竭靶點PPI（644個節點10053條邊）。將這兩個PPI 網絡相交得到一個由495 個節點6118 條邊組成的網絡圖。利用Bisogenet 插件對網絡中所有點的拓撲參數（通過度、介度中心度和接近中心度）進行分析，選擇靶點中每個靶點的度拓撲參數值大于中位數作為篩選核心靶點的條件，得到109 個節點，1385 條邊組成的氣血雙補方與慢性心力衰竭靶點網絡圖。見圖2。

2.4 GO功能富集分析利用DAVID平臺對氣血雙補方PPI網絡中涉及的109個核心靶點進行GO功能富集分析。根據發現錯誤率（false discovery rate，FDR）＜0.05，進一步確認了256 個GO 條目，其中生物過程相關的條目181 個，主要涉及血小板活化、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄負調節、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始等方面；分子功能相關的條目49 個，主要涉及蛋白質結合、轉錄因子結合、轉錄因子活性、酶結合等方面；細胞組成相關的條目26個，主要涉及蛋白質復合物、細胞質、大分子復合物等方面。FDR前20個核心靶點見附表1。

2.5 KEGG 通路富集分析利用DAVID 數據庫對篩選出的核心靶點蛋白進行KEGG 通路富集分析，對氣血雙補方PPI 網絡中涉及的109 個蛋白子信號通路中的作用進行了富集分析，分析了55.3%，得到了105 條通路。以P＜0.01，FDR＜0.05 進行篩選，其中前20條通路包括癌癥中的微小RNA、甲狀腺激素信號通路、乙型肝炎通路、南美錐蟲病、癌癥的途徑、非小細胞肺癌通路、丙型肝炎通路、FOXO 信號通路、膽堿能突觸、甲狀腺癌通路、催乳素信號通路、MAPK 信號通路、趨化因子信號通路、雌激素信號通路、急性髓性白血病通路、長期抑郁癥通路、結直腸癌通路、前列腺癌通路、B 細胞受體信號通路、HIF-1信號通路。研究表明，氣血雙補方的有效成分可能通過作用于這些信號通路來起到調控心力衰竭，從而治療疾病的目的，運用omicShare（http：//www.omicshare.com/tools/）對富集結果進行可視化處理，見圖3。

別類molecular function cellular component molecular function molecular function molecular function biological process biological process cellular component biological process molecular function molecular function biological process cellular component biological process biological process biological process molecular function molecular function molecular function molecular function率誤錯現發3.61e-21 6.36e-17 2.76e-15 5.02e-14 7.09e-14 1.32e-13 1.54e-13 2.64e-13 6.57e-13 6.64e-13 9.68e-13 9.90e-13 1.49e-12 3.71e-12 3.82e-12 9.27e-12 1.14e-11 1.14e-11 2.01e-11 2.96e-11量數因8059252738303361252520665739363232142513基目GO條的中絡1 PPI網表附稱名protein binding nucleoplasm transcription factor binding transcription factor activity，transcription factor binding enzyme binding transcription from rna polymerase ii promoter positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter nuclear part cellular response to hormone stimulus transcription cofactor activity transcription coactivator activity signal transduction nuclear lumen positive regulation of gene expression positive regulation of transcription，dna-templated negative regulation of transcription，dna-templated receptor binding hormone receptor binding transcription regulatory region dna binding nuclear hormone receptor binding號體本因基go.0005515 go.0005654 go.0008134 go.0000989 go.0019899 go.0006366 go.0045944 go.0044428 go.0032870 go.0003712 go.0003713 go.0007165 go.0031981 go.0010628 go.0045893 go.0045892 go.0005102 go.0051427 go.0044212 go.0035257

3 討論

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統進行網絡分析，選取特定信號節點（specific signal nodes，SSNS）進行多靶點藥物分子設計的新學科。將網絡藥理學與傳統中醫藥有機結合，其整體性、系統性、動態性的特點與中醫整體觀念、辨證論治的理論相一致。本研究系統分析了氣血雙補方9 味中藥的有效成分，構建化合物-靶點網絡，分析化合物與靶點的相互作用關系。其中化合物-靶點網絡中的關鍵成分是槲皮素、山奈酚、7-O-methylisomucronulatol 等。槲皮素是黃芪、枸杞子的有效成分，山奈酚是白芍的有效成分，7-0-methylisomucronulatol 是黃芪的有效成分。在化合物-靶點網絡中polr2a 有著最多的相互作用配體，CTCF 次之，RAB21 再次之。對氣血雙補方的靶點進行PPI 映射并構建網絡，對網絡分析后發現了多個與多種復雜疾病緊密相關的關鍵靶點，如ADRA1D、ADRB1、SLC6A2、XDH、ADRA2C、CHRM2、PPARA、MMP3 等。為了說明作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，研究發現氣血雙補方具有調節蛋白質復合物、RNA 調控、酶結合、轉錄因子結合、受體結合、基因表達的正調節、細胞死亡調節等方面的功能。大多數基因富集到與癌癥有直接關系的通路上，包括胰腺癌通路、腎細胞癌通路、小細胞肺癌通路、甲狀腺癌通路、癌癥通路等；另一部分負責調控信號通路，包括PI3k-Akt信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、cGMP-PKG信號通路、ErbB 信號通路、PPAR 信號通路、Fc-RI 信號通路等，另外根據分析結果推測氣血雙補方中的活性成分如何參與癌癥直接相關的通路。本研究通過借助網絡藥理學手段，預測了氣血雙補方抗慢性心力衰竭的主要作用機制，為其活性成分研究和實驗研究提供了科學的理論依據。