嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽發(fā)酵條件優(yōu)化及其呈味、抗氧化特性

馬媛媛，安飛宇，曹愷欣，趙 越，武俊瑞，史海粟，烏日娜*

（1.沈陽農業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省食品發(fā)酵技術工程研究中心，遼寧 沈陽 110866）

多肽是各氨基酸殘基以不同組合和排列方式構成的從二肽到復雜的線性、環(huán)形結構的不同肽類的總稱，其中的特異性功能肽，如呈味功能肽及生理活性肽通常由2～50個氨基酸組成[1]。目前，“BIOPEP”數(shù)據(jù)庫已報道了521個呈味功能肽及4 402個生理活性肽，其中包括呈味、抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血壓等多種生物活性[2]，其在食品、日用化工、醫(yī)藥制劑等領域的應用日益廣泛，因此受到研究人員的廣泛關注，其合成與制備方法更是研究的熱點。

目前，多肽多以酶解法制備[3]，但存在成本高、酶解條件嚴格、預處理時氨基酸易被破壞[4]問題等，而發(fā)酵是一種更為經(jīng)濟有效的方法，可通過微生物的作用產生生物活性肽和食品級蛋白質水解物，是在工業(yè)水平上生產特異性功能肽的理想方法，與酶法制備相比，其產物生物活性強、安全性高且更環(huán)保[3，5]?，F(xiàn)如今，已開展多項利用微生物法制備特異性功能肽的相關研究，如LI C等[6-8]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵制備抗氧化肽；CHEN L等[9]利用瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）發(fā)酵制備降血壓肽；MUHIALDIN B J等[10-11]利用大腸桿菌（Escherichia coli）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）制備抑菌肽。此外，本課題組前期研究表明，嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）是豆制品發(fā)酵過程中的關鍵優(yōu)勢菌種，其在發(fā)酵過程中可分泌大量酶類，將原料蛋白中的大分子蛋白分解成小分子肽及游離氨基酸，其與鮮味肽等特異性功能肽的合成代謝密切相關[12-13]。

因此，本研究以實驗室前期從自然發(fā)酵豆醬中篩選出的產多肽能力較強的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1為研究對象，以大豆蛋白為發(fā)酵基質，通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken響應面試驗對其產多肽培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并對所制備多肽的呈味特性及抗氧化特性進行初步研究，以期為其進一步的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）SNTH-1（CGMCC.No 23165）：分離自遼寧省自然發(fā)酵豆醬。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標準品（色譜純）：美國Sigma公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、乙酸鈉（無水）3 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水合硫酸鎂0.575 g/L、一水合硫酸錳0.25 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三鈉2.42 g/L、酵母浸粉4 g/L、牛肉浸膏8 g/L、吐溫80 1 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

參考ZHAO J D等[14]的方法并稍作修改，大豆蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10 g/L、乙酸鈉（無水）3 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、七水合硫酸鎂0.575 g/L、一水合硫酸錳0.25 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三鈉2.42 g/L、吐溫80 1 g/L、氯化鈉100 g/L，調整pH值至7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Eon型酶標儀：美國Biotek公司；UV-2100型紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；Insent SA402B型電子舌：日本Insent公司；LX-B50L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；PHS-3E型pH計：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

微生物發(fā)酵法制備多肽的影響因素主要包括微生物種類、培養(yǎng)基種類與組成、接種量、培養(yǎng)時間、pH值、溫度等[15]。將甘油管保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1按2%（V/V）的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，33 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，再將其按2%（V/V）的接種量接種于鹽度為10%、pH為7.0的大豆蛋白液體發(fā)酵培養(yǎng)基，33 ℃條件下培養(yǎng)，考察發(fā)酵時間（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h）對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽能力的影響。在此基礎上，依次考察發(fā)酵溫度（25 ℃、29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、鹽度（3%、5%、7%、9%、11%）、初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽能力的影響，確定最佳培養(yǎng)條件。

1.3.2 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗

（1）PB試驗

在單因素試驗結果基礎上，以多肽含量為響應值，選取發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、鹽度（D）、初始pH值（E）5個因素的高低水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行PB試驗，PB試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（2）最陡爬坡試驗

依據(jù)PB試驗結果，篩選出影響最大的3個因素進行最陡爬坡試驗，確定中心點。

（3）Box-Behnken試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以多肽含量（Y）為響應值，初始pH值（X1）、鹽度（X2）及發(fā)酵溫度（X3）為考察因素，采用Design-Expert 8.0.6軟件，進行響應面優(yōu)化試驗，確定產多肽的最佳培養(yǎng)條件，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 多肽含量的測定

參考RUAN S等[16]的方法，并稍作修改。將質量濃度分別為0、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL和20 mg/mL的四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標準溶液1 mL添加到4 mL雙縮脲試劑中，混勻，在室溫（（25±1）℃）下放置30 min，然后在波長540 nm處測定吸光度值，以四肽的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線的回歸方程為y=0.014 1x+0.06（R2=0.998）。同理，測定1 mL發(fā)酵上清液中的多肽含量。

1.3.4 粗多肽的提取

參考ZHANG Y等[17]的方法并稍作修改。發(fā)酵結束后將樣品取出，于85 ℃水浴鍋中滅酶15 min，再8 000 r/min離心15 min，取發(fā)酵液上清過0.45 μm微孔膜除去不溶物和菌體后，收集上清液并凍干作為粗多肽。

1.3.5 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽滋味特性的測定

分別以響應面試驗所確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件、優(yōu)化前的培養(yǎng)條件、空白培養(yǎng)基作為試驗組、對照組、空白組，以電子舌測試由氯化鉀和酒石酸配制的人工唾液無味點（Tasteless）組為基準[18]，當樣品的味覺值低于無味點時說明樣品無該味道，反之則有。采用電子舌技術對發(fā)酵液的滋味特性（酸味、苦味、澀味、苦味回味、澀味回味、鮮味、厚味、咸味、甜味）進行評估和比較[19]。

1.3.6 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽DPPH自由基清除率的測定

分別以響應面試驗所確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件、優(yōu)化前的培養(yǎng)條件作為試驗組、對照組，測定其抗氧化能力。參考XIE Z J等[20-21]的方法，并稍作修改。配制40 mg/mL的樣品溶液，取2 mL粗多肽液于測試管中，加入2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，混合均勻后室溫下避光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光度值A1，以體積分數(shù)95%乙醇調零，相同條件下測定2 mL體積分數(shù)95%乙醇與等體積樣品均勻混合后的吸光度值A2，以及DPPH溶液與體積分數(shù)95%乙醇等體積混合后的吸光度值A3，計算DPPH自由基清除率，其計算公式如下：

半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）表示DPPH自由基清除率為50%時抗氧化肽的質量濃度。通過調整SNTH-1粗多肽的質量濃度，選取DPPH自由基清除率在25%～85%范圍的SNTH-1粗多肽質量濃度，再進行線性擬合，即可求得IC50值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)為3次平行實驗的平均值，單因素試驗結果采用SPSS20.0軟件進行差異顯著性分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計分析，采用OriginPro2018進行作圖、DPPH自由基清除率的線性擬合。

2 結果與分析

2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、鹽度、初始pH值對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽能力的影響見圖1。

圖1 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor experiment for culture conditions optimization

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時間的延長，多肽含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，發(fā)酵前40 h多肽含量顯著增加（P＜0.05）；當發(fā)酵40 h時，多肽含量最高，為（12.78±0.16）mg/mL；發(fā)酵40 h后多肽含量變化差異不顯著（P＞0.05）。分析原因可能是發(fā)酵前期嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1處在對數(shù)生長期，菌株活性較強，具有較強的產肽能力；當發(fā)酵時間＞40 h后，菌株達到平臺期，多肽含量趨于穩(wěn)定，這與朱雯娟[22]的研究結果一致。因此，確定最佳發(fā)酵時間為40 h。

由圖1B可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽含量呈先升高后緩慢降低的趨勢，且各組間差異顯著（P＜0.05），當發(fā)酵溫度為37 ℃時多肽含量最高，為（15.15±0.23）mg/mL。分析原因可能是發(fā)酵溫度較低時，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1的活性差，且蛋白酶酶解速率低，僅有部分大豆蛋白被完全利用，從而影響其產多肽能力[23]；雖然較高的發(fā)酵溫度能提高蛋白酶酶解速率，但會抑制菌株的生長活力，不利于發(fā)酵產多肽[24]。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

由圖1C可知，隨著接種量的增加，多肽含量呈先升高后趨于平緩的趨勢，當接種量＜1%時，多肽含量存在顯著差異（P＜0.05）；當接種量＞1%時，多肽含量無顯著差異（P＞0.05）；當接種量為3%時達到最高，為（16.43±0.15）mg/mL。分析其原因可能是當接種量較少時，菌體生長緩慢，菌體密度低，發(fā)酵培養(yǎng)基中的大豆蛋白未被完全利用，致使多肽含量較低；而較多的接種量，會導致發(fā)酵初期菌體生長速度過快，細胞過早老化，發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的匱乏，致使產多肽能力下降[22]。因此，確定最佳接種量為3%。

由圖1D可知，隨著鹽度的增加，多肽含量呈先快速升高后緩慢降低的趨勢，各組間存在顯著差異（P＜0.05），當鹽度為5%時達到最高，為（21.45±0.30）mg/mL。分析其原因可能是嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1作為中度嗜鹽菌，適宜的鹽度能提高菌株的生長活性，有利于蛋白酶等代謝產物的產生，從而提高產多肽能力[25-26]。因此，確定最佳鹽度為5%。

由圖1E可知，隨著初始pH值的升高，多肽含量總體呈先上升后下降的趨勢，各組間均存在顯著差異（P＜0.05）；當初始pH值為8.0時，多肽含量達到最高，為（28.67±0.34）mg/mL。分析其原因可能是pH會影響菌體的細胞膜滲透度和營養(yǎng)離子化程度，從而影響嗜鹽四聯(lián)球菌的生長代謝[27-28]。而嗜鹽四聯(lián)球菌生長時利用葡萄糖產酸，弱堿的環(huán)境可與酸綜合，縮短延滯期，這與王博[29]的研究結果一致。因此，確定最佳初始pH值為8.0。

2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產多肽培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 PB試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以多肽含量為響應值，進行PB試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3及表4可知，各因素對多肽含量影響的順序為初始pH值＞鹽度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量；初始pH值對多肽含量的影響高度顯著（P＜0.01），鹽度、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對多肽含量的影響顯著（P＜0.05），而接種量對多肽含量的影響不顯著（P＞0.05）。同時，單因素試驗結果表明，當多肽含量達到峰值后，即使隨著發(fā)酵時間的延長，其含量仍保持穩(wěn)定。因此，選定對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵產多肽影響最大的3個因素（發(fā)酵溫度、鹽度、初始pH值）進行最陡爬坡試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗結果

由PB試驗結果可知，初始pH值（X1）、鹽度（X2）、發(fā)酵溫度（X3）均呈顯著正效應（P＜0.05），應逐步增加。利用最陡爬坡試驗，初步確認最大多肽含量區(qū)域，有效建立響應面擬合方程。最陡爬坡試驗設計及結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

由表5可知，當初始pH值為8.0、鹽度為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃時，多肽含量達到最高，為29.81 mg/mL。因此，確定初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37 ℃、鹽度5%為響應面試驗的中心點。

2.2.3 響應面試驗設計與結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件，在PB試驗的基礎上，以最陡爬坡試驗結果為依據(jù)，多肽含量（Y）為響應值，確定初始pH值8.0、發(fā)酵溫度37 ℃、鹽度5%為中心點，進行3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，共計17組，設計方案及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表6中的多肽含量進行多元線性回歸擬合，最終得到回歸方程：

由表7可知，模型的P＜0.001，表明該二次回歸方程模型極顯著（P＜0.001）。同時失擬項P=0.703 8＞0.05，不顯著，說明響應面試驗結果和數(shù)學模型擬合度較高，能較好解釋響應中的變異。決定系數(shù)R2為0.992 2，說明此方程對試驗擬合度結果比較好，誤差小；校正決定系數(shù)R2Adj為0.982 1，表明能解釋試驗中98.21%響應值的變化并且試驗誤差較小，說明此回歸模型能對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵制備多肽的效果進行較好地分析與預測。另一方面，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.91%＜10%，說明本試驗的置信度良好[30-31]，也從另一方面表明此模型的可靠性。由表7亦可知，影響多肽含量的主次順序依次為X1＞X2＞X3，即初始pH值＞鹽度＞發(fā)酵溫度。一次項X1及二次項X12、X22、X32對結果影響極顯著（P＜0.001），一次項X2及交互項X1X2、X2X3對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

根據(jù)曲面的陡峭程度能判斷各因素間交互作用對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽能力影響的顯著性，曲面越陡峭，影響越顯著，反之不顯著，也可根據(jù)等高線的形狀判斷顯著性[32]。各因素及其交互作用對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽能力影響的響應面及等高線見圖2。

由圖2可知，初始pH值與鹽度、鹽度與發(fā)酵溫度間的交互作用的響應面呈凸面，說明存在最大值，坡度較陡峭，等高線呈閉合的橢圓形，說明各因素間交互作用明顯，而初始pH值與發(fā)酵溫度間交互作用的響應面坡度較平坦，且等高線近似圓形，表明初始pH值和發(fā)酵溫度間的交互作用對多肽含量的影響沒有顯著性，該結果與方差分析結果一致。

圖2 各因素間交互作用對嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產多肽含量影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of interaction between various factors on the contents of peptide produced by Tetragenococcus halophilus SNTH-1

2.2.4 最佳發(fā)酵條件的確定

利用響應面優(yōu)化確定最佳條件為發(fā)酵時間40 h、鹽度5.23%、發(fā)酵溫度37.06 ℃、接種量3%、初始pH值8.08。在此條件下，多肽含量預測值為33.15 mg/mL。為便于實際操作，將最佳發(fā)酵條件修正為發(fā)酵時間40 h、鹽度5.2%、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3%、初始pH值8.1。在此優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，多肽含量實際值為（32.96±0.02）mg/mL，與模型預測值接近，說明該回歸模型優(yōu)化出的工藝參數(shù)較為準確，具有較高可行性，可實際應用。

2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1發(fā)酵液呈味肽分析

基于樣品基質呈味的復雜性，應用電子舌技術，測定嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的酸味、苦味、澀味、苦味回味、澀味回味、鮮味、厚味、咸味、甜味，結果見圖3。

圖3 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產粗多肽呈味特性電子舌測定結果Fig.3 Taste characteristics of crude peptides produced by Tetraplococcus halophilus SNTH-1 determined by electronic tongue

由圖3可知，試驗組、對照組、空白組的咸味、鮮味的味覺值較高，甜味居中，苦味較低，均高于無味點組，可作為評價風味的有效指標；而酸味、澀味、苦味回味、澀味回味的味覺值低于無味點組，不呈味。試驗組的鮮味、厚味、咸味、甜味、苦味的味覺值均高于對照組、空白組，說明優(yōu)化后的發(fā)酵條件增強了嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產粗多肽的鮮味、厚味、咸味、甜味和苦味的表達。而苦味的增加可能是因為嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1生長所產生的蛋白酶、肽酶等代謝產物，將大分子蛋白降解生成小分子肽和游離氨基酸，釋放了易于苦味受體結合的苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸等[33]，從而產生苦味。

2.4 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的抗氧化能力分析

基于樣品基質復雜的生物活性，測定嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的DPPH自由基清除率，結果見圖4。

由圖4可知，DPPH自由基清除率與嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的質量濃度呈正相關，隨著多肽質量濃度的增加，DPPH自由基清除率也在逐漸增大，且試驗組多肽的DPPH自由基清除率高于對照組，說明優(yōu)化后的發(fā)酵條件提高了嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的抗氧化性。試驗組嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽清除DPPH自由基的IC50值為0.22 mg/mL。HE R等[34]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）固態(tài)發(fā)酵制備的菜籽肽清除DPPH自由基的IC50值為0.165 mg/mL；龍久鈴等[35]利用米曲霉（Aspergillus oryzae）固態(tài)發(fā)酵制備的蘇麻餅粕肽清除DPPH自由基的IC50值為0.17 mg/mL，略低于嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1粗多肽的IC50值。綜上所述，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產多肽中可能存在具有抗氧化能力的生理活性肽，具有一定的應用潛力。

圖4 嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1產粗多肽發(fā)酵條件優(yōu)化前后的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of crude peptide produced by Tetraplococcus halophilus SNTH-1 before and after fermentation condition optimization

3 結論

本研究以高產多肽的嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1為研究對象，通過單因素試驗、PB試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗優(yōu)化確定其產多肽的最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間40 h、鹽度5.2%、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3%、初始pH值8.1，該條件下多肽含量為（32.96±0.02）mg/mL，嗜鹽四聯(lián)球菌SNTH-1所產粗多肽的鮮味、厚味、咸味、甜味、苦味及DPPH自由基清除率比優(yōu)化前均有所提高，且清除DPPH自由基的IC50值為0.22 mg/mL。