濃香型白酒風味成分對乙醇代謝及關鍵酶活性影響的體內實驗研究

劉嬡春，曾禮蘭，方 帥，王有鈞，夏 嶼，王 艷，趙盈盈，孫 群，胡 承*

（1.四川大學 生命科學學院，四川 成都 610064；2.四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；3.四川大學 錦江學院白酒學院，四川 眉山 620800）

作為世界上六大著名蒸餾酒之一，白酒是一項充滿創造智慧和文化魅力的發明[1]，在中國商業發酵產品中發揮著重要作用。通常以糧谷為主要原料，以大曲、小曲、麩曲、酶制劑及酵母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、陳釀、勾調而成[2]。近年來，隨著生活水平的提高和生活方式的改變，中國飲酒人群保持著較大基數。盡管許多研究表明適度飲酒有助于身體健康[3-5]，但過量飲酒也會導致多種疾病[6-11]。由于肝臟是乙醇代謝的主要器官，因此，長期大量飲酒會導致嚴重的肝臟類疾病[12-13]。

酒在人體內以乙醇代謝為主。飲酒后，乙醇經口腔、胃和腸道被吸收[14]，只有小部分通過肺、尿液或汗液直接排出，約95%的乙醇被肝臟氧化代謝[15]，主要的氧化途徑有：包括乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的乙醇脫氫酶氧化系統，微粒體乙醇氧化酶系統以及過氧化氫酶途徑[16]。正常情況下，ADH和ALDH途徑是乙醇代謝最主要的途徑，首先，乙醇被ADH氧化為乙醛，然后通過ALDH氧化為乙酸[17]，乙酸最終通過三羧酸循環代謝為二氧化碳和水排出體外[18]。但當乙醇超過酶的代謝能力時，代謝產物會在體內積聚，研究表明，乙醛積聚是飲酒后產生有害影響的主要因素，包括面部發紅、頭痛、惡心和嘔吐、肝硬化和癌癥[19-20]等。

目前的研究集中于將ADH和ALDH作為靶點，篩選天然解酒成分及開發新型解酒產品[21-22]，或是通過模擬白酒特征成分的組成自制白酒，探究乙醇及其同系物對乙醇代謝的影響[23-24]。然而，酒體風味成分對乙醇代謝關鍵酶的作用及調控一直被忽略。實際上，白酒主要由水、乙醇（占98%）和微量成分（占2%）組成，成分對白酒風味起決定性作用[25]。隨著風味成分組成和含量研究的深入，發現白酒具有溶膠體系部分屬性，多種成分間相互影響、相互作用可能會影響體內乙醇的主要代謝效率，間接導致不同產地的白酒產生不同的生理乃至心理效應。

在之前的實驗中[26]，采用增量法和分光光度法測定了四種濃香型白酒中10種代表性風味成分（醇類和酯類）對ADH和ALDH活性的影響。結果表明醇類和酯類的加入會抑制ADH活性；而除了正丙醇，其他醇類和酯類濃度的升高會不同程度地促進ALDH活性，且向酒樣中添加不同的風味成分對兩種酶的抑制率也有所不同。ADH作為乙醇代謝過程中的第一個酶，其氧化速率決定了乙醇代謝能否順利完成，因此，本研究選擇酶學實驗中對ADH抑制率高（＞15%）的樣品[26]，通過構建小鼠灌胃模型，灌胃白酒、高醇白酒、高酯白酒及同濃度的酒精溶液，測定不同白酒及其主要風味成分的增量變化對乙醇代謝及其關鍵代謝酶的影響，對于行業優化酒體設計乃至引導消費者樹立正確的飲酒觀念和飲酒方法等方面有著重要的理論依據和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗小鼠和白酒樣品

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的雄性昆明小鼠（20±2）g（許可證號：SYXK（川）2019-189）：成都達碩實驗動物有限公司。

不同乙醇濃度的濃香型白酒樣品（SC1：68%vol、SC2：48%vol、SC3：38%vol）：四川某酒廠；濃香型白酒樣品（JS：40.8%vol）：江蘇某酒廠。采用氣相色譜法測定白酒中代表醇類和酯類含量[26]，結果見表1。

表1 濃香型白酒中代表性醇類和酯類的濃度Table 1 Concentrations of representative alcohols and esters in strong-flavor Baijiu

1.1.2 化學試劑

異丁醇、正戊醇、異戊醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯（均為色譜純）：天津精細化工研究所；叔丁醇、乙腈（均為色譜純）、小鼠乙醇脫氫酶酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠乙醛脫氫酶ELISA試劑盒：成都容辰嘉華生物技術有限公司；1 mL肝素鈉抗凝管：江蘇康健醫療用品有限公司。

1.2 儀器與設備

GC911-III型氣相色譜儀、WondaCap WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：四川知本分析科技有限公司；PRACTUM224-1CN電子分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；F6/10-10G型FLUKO超細勻漿器：上海弗魯克流體機械制造有限公司；Biofuge stratos臺式高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；SpectraMAX Plus384酶標儀：上海美谷分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣預處理

實驗組樣品：通過計算表1中風味成分含量與總含量的比值，將風味成分（異丁醇、正戊醇、異戊醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯）以1%的添加量分別添加到酒樣中[26]，充分搖勻。

酒精對照組樣品：將酒精溶液的酒精含量分別調整為68%vol、48%vol、38%vol、40.8%vol。

1.3.2 實驗動物分組及處理

SPF級的雄性昆明小鼠飼養于溫度為（20±2）℃，相對濕度為（60±2）%，光照/黑暗周期為12 h的房間內。適應性喂養3 d后，將小鼠隨機分為空白組、酒精對照組和酒樣組（SC1組、SC2組、SC3組、JS組），再將SC1組分為：SC1酒樣組、SC1+異丁醇組、SC1+正戊醇組、SC1+戊酸乙酯組；將SC2組分為SC2酒樣組、SC2+異丁醇組、SC2+丁酸乙酯組、SC2+己酸乙酯組；將SC3組分為SC3酒樣組、SC3+丁酸乙酯組；將JS組分為JS酒樣組、JS+異丁醇組、JS+異戊醇組、JS+丁酸乙酯組，共17組，每組各6只。每天上午9點灌胃一次，連續7d。初始灌胃劑量為2.5 mL/kg體質量，每次增加1 mL/kg體質量，最后一次灌胃劑量為10 mL/kg體質量，每次灌胃前稱體質量，以調整灌胃劑量。實驗期間小鼠自由飲水及攝食。

1.3.3 行為學測定

曠場實驗：實驗裝置為聚乙烯塑料露天場地（100 cm×100 cm×40 cm）[27]，觀察并記錄小鼠在灌胃10 min內的行走次數和站立次數。每次實驗之間用體積分數為75%乙醇擦拭場地，避免殘留氣味或分泌物等因素影響小鼠行為[1]。

平衡木實驗：一根水平木桿（60 cm×1 cm）懸掛在裝有墊料的盒子上方50 cm處。根據文獻方法[28]，在實驗前一天，訓練每只小鼠通過平衡木3次，如果小鼠不能走到另一端，可以輕推臀部或稍微扭動尾巴來誘導其移動。正式實驗前，將小鼠移入實驗室適應2 h。灌胃10 min后，將每只小鼠置于平衡木的一端觀察其行為，并記錄行走評分。評分標準如下：順利通過平衡木得1分，前肢或后肢滑落得2分，懸掛或抱住平衡木得3分，直接跌落得4分。

1.3.4 血液中乙醇和乙醛濃度的測定

采用氣相色譜法測定血液中乙醇和乙醛的濃度。

樣品前處理：第7天灌胃2 h后，采用摘眼球法取血，將血樣置于肝素鈉抗凝管中，5 000 r/min離心15 min后，收集500μL上清液，加入叔丁醇（1mg/mL，20μL）和乙腈（1mg/mL，480 μL），混合后10 000 r/min離心10 min，通過0.22 μm有機濾膜過濾。

氣相色譜條件：GC911-III型氣相色譜儀上配有Wonda Cap WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，柱流量為1.5 mL/min，分流比為1∶20，進樣量為1 μL。柱溫為程序升溫，升溫條件：烘箱溫度最初為48 ℃，以3 ℃/min的加熱速率升溫至55 ℃，維持6 min，再以30 ℃/min的速率升溫至200 ℃，維持2 min。

1.3.5 肝臟中ADH和ALDH活性的測定

小鼠取血后采用頸椎脫臼法處死。立即取出肝臟，用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后儲存于-80 ℃，隨后根據試劑盒的原理與方法采用雙抗體夾心法檢測小鼠肝臟中ADH和ALDH水平。

1.3.6 統計分析

所有實驗結果均采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件分析，使用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗進行組間比較。P＜0.05認為差異有統計學意義。使用Graphpad prism 8.0軟件繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 行為學測定

曠場實驗根據動物的趨避性，可用于檢測小鼠在新環境中的自發活動行為以及探索行為[29]。曠場實驗的行為指標測定結果見圖1。由圖1A可知，灌胃SC1酒樣后，小鼠站立次數增多，行走次數減少；SC1+正戊醇組、SC1+戊酸乙酯組小鼠行走次數多于68%vol酒精溶液組、SC1酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖1B可知，灌胃SC2酒樣后，小鼠站立次數和行走次數增多；SC2+異丁醇組小鼠行走次數少于SC2酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖1C可知，灌胃SC3酒樣后，小鼠站立次數增多，行走次數減少。由圖1D可知，灌胃JS酒樣后，小鼠站立次數減少；JS+丁酸乙酯組小鼠行走次數少于40.8%vol酒精溶液組、JS酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。與空白組相比，酒樣組和酒精對照組小鼠站立次數均增加，說明小鼠的活動能力和探索能力均受到了乙醇影響，且灌胃不同產地的濃香型白酒后行為表現有著差異。研究表明，異戊醇含量愈高的濃香型白酒，飲后不適感愈強，影響小鼠的自發行動[30]。

圖1 小鼠曠場實驗行為指標測定結果Fig.1 Determination results of behavioral indicators by open field test of mice

平衡木是測試小鼠的平衡能力、肌肉力量和運動協調性，急性酒精過量會導致共濟失調，表現為身體運動不協調和平衡障礙[31]，分數越高表示共濟失調越嚴重。小鼠平衡木實驗行為指標測定結果見圖2。由圖2可知，與空白組相比，酒樣組和酒精對照組均表現出輕微甚至明顯的身體不協調，且酒樣組的行走得分高于酒精對照組，表明酒精會引起共濟失調，而白酒中的風味成分會加劇這種現象。由圖2A可知，SC1+異丁醇組的小鼠行走評分最高，造成的共濟失調最嚴重。由圖2B可知，SC2+異丁醇組小鼠行走評分高于48%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；SC2+丁酸乙酯組小鼠行走評分減小。由圖2C可知，SC3+丁酸乙酯組小鼠行走評分低于SC3酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖2D可知，JS酒樣組、JS+異丁醇組、JS+異戊醇組、JS+丁酸乙酯組小鼠行走評分均高于40.8%vol酒精溶液組。

圖2 小鼠平衡木實驗行為指標測定結果Fig.2 Determination results of behavioral indicators by balance beam test of mice

在白酒醇類物質中，高級醇對人體的麻醉作用高于乙醇，高級醇可抑制神經中樞，飲后易出現神經系統充血、頭痛等癥狀[32]。謝佳等[24]發現白酒中的異丁醇、異戊醇會抑制乙醇代謝，從而增加醉度，表現出共濟失調。徐佳楠等[33]推斷引起小鼠飲酒后舒適度降低，行為受到抑制的原因與酒體中高級醇含量過高、酸酯比例不協調有關。

2.2 白酒中的醇類和酯類對血液中乙醇和乙醛含量的影響

小鼠灌胃模型采用逐漸增加白酒劑量的方法，是為了降低小鼠突然攝入高濃度乙醇導致急性損傷甚至死亡。小鼠血液中乙醇和乙醛含量測定結果見圖3。由圖3A可知，SC1+異丁醇組、SC1+正戊醇組小鼠血液乙醇濃度高于68%vol酒精溶液組、SC1酒樣組，差異顯著（P＜0.05）；SC1酒樣組、SC1+戊酸乙酯組小鼠血液乙醇含量高于68%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；SC1+異丁醇組、SC1+正戊醇組小鼠血液乙醛含量高于68%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）。由圖3B可知，SC2+異丁醇組、SC2+丁酸乙酯組、SC2+己酸乙酯組小鼠血液乙醇含量均高于48%vol酒精溶液組、SC2酒樣組，差異顯著（P＜0.05）；SC2酒樣組小鼠血液乙醇含量高于48%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；SC2+丁酸乙酯組小鼠血液乙醛含量高于48%vol酒精溶液組、SC2酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖3C可知，SC3+丁酸乙酯組小鼠血液乙醇含量高于SC3酒樣組，差異顯著（P＜0.05）；SC3+丁酸乙酯組小鼠血液乙醛含量高于38%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）。由圖3D可知，JS+異戊醇組小鼠血液乙醛含量高于40.8%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）。

圖3 小鼠血液中乙醇和乙醛含量測定結果Fig.3 Determination results of ethanol and acetaldehyde contents in mice blood

研究表明，高級醇類物質在體內的氧化分解速度比乙醇慢，在體內停留時間較長[34]，對人體具有一定毒性，是引起不良醉酒反應潛在的有害物質[35]。同時，在相同的乙醇含量下，酒精飲料比酒精溶液對人體肝臟組織造成的損害更大，因為乙醇及其同系物之間的相互作用增強了肝臟的氧化特性[36]，或高級醇可以抑制三羧酸循環[37]，降低乙醇的氧化速率[38]，進而影響乙醇的代謝，導致有害物積累，最終對機體造成損傷。本研究結果發現，分別灌胃含有高濃度異丁醇、異戊醇的白酒會增加小鼠血液中乙醇和乙醛的含量，降低小鼠的協調能力。但也有研究指出威士忌中適量的高級醇具有減輕宿醉癥狀的作用[39]，說明不同白酒飲用舒適度的差異與其所含的成分密切相關。

2.3 白酒中醇類和酯類對肝臟中ADH和ALDH活性的影響

ADH分解乙醇的速度主要與ADH的活性有關，小鼠肝臟中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活性測定結果見圖4。由圖4A可知，SC1酒樣組、SC1+正戊醇組、SC1+戊酸乙酯組小鼠肝臟ADH活性與68%vol酒精溶液組相比有顯著差異（P＜0.05）；SC1+異丁醇組小鼠肝臟ADH活性低于SC1酒樣組，差異顯著（P＜0.05）；SC1+異丁醇組、SC1+正戊醇組、SC1+戊酸乙酯組小鼠肝臟ALDH活性低于68%vol酒精溶液組、SC1酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖4B可知，SC2+異丁醇組、SC2+己酸乙酯組小鼠肝臟ALDH活性低于48%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；SC2+丁酸乙酯組小鼠肝臟ALDH活性高于48%vol酒精溶液組、SC2酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖4C可知，SC3酒樣組小鼠肝臟ALDH活性低于38%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；SC3+丁酸乙酯組小鼠肝臟ALDH活性高于SC3酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。由圖4D可知，JS+異戊醇組小鼠肝臟ADH活性高于40.8%vol酒精溶液組，差異顯著（P＜0.05）；JS酒樣組、JS+異丁醇組小鼠肝臟ALDH活性與40.8%vol酒精溶液組相比有顯著差異（P＜0.05）；JS+異戊醇組小鼠肝臟ALDH活性低于JS酒樣組，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 小鼠肝臟中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活性測定結果Fig.4 Determination results of activities of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase in mice liver

適量的酯類使白酒口感醇厚，香氣持久，回味甘甜。相關研究發現，乙酸乙酯可以促進乙醇代謝，顯著降低白酒的醉酒程度[24]。然而，在本研究中，雖然在SC2和SC3酒樣中添加丁酸乙酯可以增強ADH和ALDH酶活性，但它也增加了血液中乙醇和乙醛的含量。值得注意的是，本研究是從風味成分的整體和系統層面出發，采用增量法添加白酒固有風味成分的濃度，進一步闡明其濃度對乙醇代謝途徑的影響。

總的來說，小鼠灌胃實驗中風味成分對肝臟ADH和ALDH活性的影響可分為三類：①大多數風味成分同時抑制ADH和ALDH活性；②促進ADH活性而抑制ALDH活性，如SC1酒樣中添加異丁醇，SC2酒樣中添加異丁醇和己酸乙酯，JS酒樣中添加異戊醇和丁酸乙酯；③同時促進ADH和ALDH的活性，如向SC2和SC3酒樣中添加丁酸乙酯。

2.4 小鼠血液中乙醇、乙醛含量與肝臟中ADH、ALDH活性相關性分析

由圖5A可知，小鼠肝臟中ADH活性與與血液中的乙醇含量之間沒有相關性（相關系數R2=0.005 2，P＞0.05）；由圖5B可知，小鼠肝臟中ADH活性與血液中乙醛含量之間沒有相關性（相關系數R2=0.032 1，P＞0.05）；由圖5C可知，小鼠肝臟中ALDH活性與血液中的乙醛含量沒有相關性（R2=0.086 3，P＞0.05）；由圖5D可知，小鼠肝臟中ALDH活性與血液中乙醇含量弱相關（相關系數R2=0.236 1，P＜0.05），即分別灌胃白酒、高醇白酒、高酯白酒和相同濃度的酒精溶液后，小鼠肝臟中ALDH活性與血液中乙醇含量的變化有一定的聯系，但聯系的緊密程度較低。

圖5 小鼠血液中乙醇、乙醛含量與肝臟中乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶活性之間的關系Fig.5 Relationship between the contents of ethanol,acetaldehyde in blood and activities of alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase in liver of mice

本研究中，在白酒中加入某幾類醇類和酯類物質，對ADH和ALDH的抑制作用增強，且對ADH的抑制作用更為顯著。然而，經過相關性分析發現，白酒和風味成分的變化對乙醇和乙醛含量的影響并不完全取決于ADH和ALDH的活性。一項研究報告稱，缺少某一類酸和酯的白酒對ADH和ALDH酶活性的影響不能作為乙醇和乙醛含量變化的原因[24]；也有研究指出，影響血液中乙醇和乙醛含量的飲料[40]和水果[41]不是通過改變ADH和ALDH的活性，可能是通過非酶促方式，如改變乙醇在胃和腸中的吸收或通過呼吸和尿液介導乙醇的排泄。而且，與ADH相比，微粒體乙醇氧化系統對乙醇的親和力較低，因此，在酒精濃度低到中等時，乙醇的代謝主要由ADH催化，而當酒精濃度過高時，微粒體乙醇氧化系統被誘導激活，導致更多的乙醇被氧化成乙醛[42]。

3 結論

最近關于風味成分對乙醇代謝和人體健康影響的研究仍集中在表型研究上，缺乏有效的體內實驗來驗證這些成分的生理功能。因此，本研究采用增量法增加白酒中典型高級醇類和酯類的濃度，構建小鼠灌胃模型，結合乙醇代謝相關酶的分析，在不變動酒樣中復雜成分的絕對濃度的前提下初步論證了白酒中主要風味成分對有關酶系的整體效果。本研究僅以濃香型白酒為材料，以乙醇脫氫酶系統為研究對象展開初步研究，之后的實驗將擴展到其他品類的白酒以及肝臟中其他相關代謝酶，這將有助于系統研究白酒中風味成分對乙醇代謝的影響，讓消費者科學認識白酒對人體健康的利弊關系，促進行業在提高風味品質和減少對飲用者健康的負面影響之間尋求平衡并持續努力。