響應面法優化蕎麥醋醋酸發酵工藝的研究

祁宏山，王治業，彭軼楠，梁 燕，季 彬*

（1.甘肅省科學院 生物研究所，甘肅 蘭州 730099；2.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730099）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench）的碳水化合物主要是淀粉[1-4]，因為其顆粒較細小，所以和其他谷類相比，具有容易煮熟、容易消化、容易加工的特點[5-6]。蕎麥含有豐富的膳食纖維，可以促進胃腸蠕動，對于預防便秘有很好的作用[7-8]。蕎麥不僅營養全面，而且富含生物類黃酮[9]、糖醇、多肽和D-手性肌醇等高活性藥用成分[10-11]，具有降脂、降糖、抗衰老、抗氧化[12-13]的功能。

我國具有悠久的釀醋歷史，食醋已經成為人們生活中不可缺少的一種調味品，并且需求量非常大。以蕎麥為原料的蕎麥醋[14-16]新產品，在保持原有食醋品質的基礎上增加了蕎麥特有的營養物質，正日益受到越來越多人的喜好。

醋酸發酵是蕎麥醋釀造過程中的一個關鍵環節，目前醋酸發酵多處于手工或半機械化狀態，對發酵過程的控制比較依賴人為經驗。楊芙蓮等[17]利用正交分析法對蕎麥醋醋酸發酵條件進行優化，探討了不同接種量、發酵液酒精度、發酵溫度、搖床轉速和瓶裝量對發酵的影響；劉旭[18]采用酶法和曲法進行糖化，經酒精和醋酸發酵釀造出了具有特殊風味的保健型蕎麥醋，探討并提出了提高黃酮類化合物利用率的措施；張素云[19]以苦蕎加工副產物（碎米及皮粉）為主料釀造優質苦蕎醋，采用正交試驗設計優化液態苦蕎醋釀造工藝。響應面法是指通過一系列確定性試驗，用多項式函數來近似隱式極限狀態函數。通過合理地選取試驗點和迭代策略，來保證多項式函數能夠在失效概率上收斂于真實的隱式極限狀態函數的失效概率。康超等[20]以百香果為原料，總酸含量為評價指標，通過單因素試驗及響應面法優化液態發酵百香果果醋的發酵工藝條件。

本研究以蕎麥為原料制備蕎麥醋，通過單因素試驗和響應面試驗優化蕎麥醋醋酸發酵階段工藝條件，旨在為企業的生產提供理論支持和技術支撐，促進企業健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥、麩皮、稻殼、谷糠：甘肅萬佳現代農牧業發展服務有限公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津市化工三廠有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AS型干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；JA203P型分析天平：常州幸運電子設備有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；RE-201D型旋轉蒸發儀：北京依諾泰儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥醋加工工藝流程及操作要點

操作要點：

蕎麥粉碎40目后加入300%～350%水（以主糧質量計算），潤料8～12 h，加熱液化，在90～92 ℃保溫1 h，降溫到65 ℃時，加入糖化酶進行糖化，在60～65 ℃范圍內保溫2 h，冷卻到30 ℃后加入20%大曲（以主糧質量計）和30%固定化酵母液（以主糧質量計），降溫至25 ℃時泵入發酵罐中進行酒精發酵，發酵時間5～7 d。酒精發酵結束以后，在發酵酒醪中拌入150%麩皮、70%稻殼、30%谷糠（以主糧質量計算），并調節拌醅酒精度和醋醅水分含量，翻拌均勻后在表面接入10%左右火醅（已發酵2 d的醋醅），入池進行醋酸固態發酵。醋醅起溫后每天翻醅1～2 次，以提供充足的氧氣便于醋酸菌生長繁殖，同時注意控制醋醅溫度不超過42 ℃（防止燒醅）。當醋醅酒精度低于0.3%vol時可壓醅，此時發酵溫度為34～36 ℃，發酵時間為9～11 d。淋醋采用三組套淋法，循環萃取。在第③組醋醅中加入自來水浸淋，淋出液加入第②組醋醅中淋出二級醋，再以二級醋加入第一組醋醅中浸泡20～24 h后淋出的，即為一級醋。經過滅菌包裝獲得蕎麥醋成品。

1.3.2 蕎麥醋醋酸發酵工藝優化

（1）單因素試驗

分別考察拌醅酒精度、火醅接種量、醋醅水分含量及發酵時間4個因素對蕎麥醋總酸含量的影響，拌醅酒精度分別設置為4.00%vol、4.25%vol、4.50%vol、4.75%vol、5.00%vol；火醅接種量設置為8%、10%、12%、14%、16%；醋醅水分含量設置為50%、55%、60%、65%、70%；發酵時間設置為7 d、8 d、9 d、10 d、11 d。

（2）響應面試驗

在單因素醋酸發酵試驗的基礎上，固定發酵時間為9 d，以拌醅酒精度（A）、火醅接種量（B）、醋醅水分含量（C）這3個因素為自變量，以蕎麥醋總酸含量（Y）為響應值，設計3因素3水平響應面試驗，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 醋酸發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for acetic acid fermentation process optimization

1.3.3 分析檢測

采用酸堿中和法[21]測定蕎麥醋中總酸含量，每組數據進行3次平行實驗，測定結果取平均值。

1.3.4 數據處理

單因素制圖采用Origin 9.0軟件，響應面模型擬合采用Design-Expert10.0.7軟件。

2 結果與分析

2.1 蕎麥醋醋酸發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 拌醅酒精度對蕎麥醋總酸含量的影響

由圖1可知，隨著拌醅酒精度在4.00%vol～4.50%vol范圍內的升高，總酸含量開始逐漸增加；當拌醅酒精度為4.50%vol時，總酸含量達到最高值，拌醅酒精度＞4.50%vol之后，總酸含量又逐漸降低。當拌醅酒精度較低時，醋酸菌轉化產生的醋酸含量低，當拌醅酒精度偏高時，一方面醋酸菌對酒精的耐受能力降低，從而抑制醋酸菌的生長，另一方面酒精度越高揮發越快，從而導致總酸含量降低[22-25]。因此，選擇最佳拌醅酒精度為4.50%vol。

圖1 拌醅酒精度對蕎麥醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of Banpei alcohol content on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.2 火醅接種量對蕎麥醋總酸含量的影響

由圖2可知，當火醅接種量在8%～12%的范圍內增加時，蕎麥醋總酸含量呈逐漸升高的趨勢；當火醅接種量在12%時，總酸含量達到最高值；當火醅接種量＞12%之后，總酸含量逐漸降低。火醅接種量過大，需要更多的營養物質用于醋酸菌自身的繁殖，導致生成的醋酸較少，同時隨著醋酸菌增多，菌體出現老化和自溶現象，從而導致總酸含量降低。因此，選擇最佳火醅接種量為12%。

圖2 火醅接種量對蕎麥醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of Huopei inoculum on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.3 醋醅水分含量對蕎麥醋總酸含量的影響

由圖3可知，當醋醅水分含量為50%～65%時，總酸含量隨之增高；當醋醅水分含量為65%時，蕎麥醋的總酸含量最高；當醋醅水分含量＞65%之后，總酸含量逐漸下降。水是醋酸菌進行代謝活動的介質，同時參與部分生化反應。醋醅含水量過低時，營養物質不易擴散，阻礙醋酸菌的生長代謝[26-29]，醋醅含水量過高時，醋醅的透氣性能降低，導致醋醅疏松度不夠，供氧不足，不利于醋酸菌的生長繁殖，從而導致總酸含量降低。因此，選擇最佳醋醅水分含量為65%。

圖3 醋醅水分含量對蕎麥醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of Cupei moisture on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.4 發酵時間對蕎麥醋總酸含量的影響

由圖4可知，隨著醋酸發酵時間在7～9 d范圍內的增加，蕎麥醋總酸含量隨之逐步增加；當發酵時間為9 d時，總酸含量達到最大值；隨著醋酸發酵時間在9～11 d范圍內的延長，總酸含量又稍微有所下降。發酵前期營養物質充足，醋酸菌生長繁殖快，醋酸生成速度逐步加快，當發酵接近尾聲時，醋酸揮發增加，造成總酸含量的降低。因此，選擇最佳發酵時間為9 d。

圖4 發酵時間對蕎麥醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid contents of buckwheat vinegar

2.2 蕎麥醋醋酸發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計結果及分析

在單因素試驗分析結果的基礎上，以總酸含量（Y）為響應值，固定發酵時間為9 d，考察拌醅酒精度（A）、火醅接種量（B）、醋醅水分含量（C）對蕎麥醋總酸含量的影響。采用Design-Expert10.0.7軟件進行3因素3水平的響應面試驗設計，每組試驗重復3次。Box-Behnken試驗設計結果見表2。

表2 醋酸發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for acetic acid fermentation process optimization

2.2.2 響應面試驗方差分析

應用Design-Expert 10.0.7軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到總酸含量與各因素的二次多項回歸方程為：Y=4.89-0.064A-0.12B-0.012C-0.085AB-0.098AC+0.027BC-0.54A2-0.40B2-0.39C2。為了驗證方程的可靠性，對方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表

由表3可看出，該模型P值＜0.000 1，說明試驗采用的二次模型極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.067 3＞0.05，說明模型高度可靠。該模型的模型信噪比（signal to noise ratio，SNR）=21.225＞4，說明模型可靠性較高，抗干擾能力較強；該模型的變異系數（coefficient of variation，CV）=1.74%，數值較小，表明模型精密度和準確度均較高；該模型決定系數R2=0.987 5，調整決定系數R2Adj=0.971 4，二者數值比較接近，說明模型的擬合度良好，誤差較小。由P值可知，一次項A、交互項AC對結果影響顯著（P＜0.05），一次項B、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其余均為不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對總酸含量的影響順序依次為B（火醅接種量）＞A（拌醅酒精度）＞C（醋醅水分含量）。

2.2.3 各因素交互作用影響分析

通過Design-Expert 10.0.7軟件對表2的試驗數據進行多項二次回歸擬合分析，得到各因素交互作用對結果影響的響應面和等高線見圖5。各因素及其交互作用對蕎麥醋總酸含量的影響可以通過響應面及等高線圖直觀的反映出來。曲面坡度越陡，等高線越近似于橢圓，說明兩者的交互作用越顯著。由圖5可知，AB、AC、BC的響應曲面坡度較陡，等高線圖接近橢圓形，所以拌醅酒精度（A）和醋醅水分含量（C）的交互作用對總酸含量影響顯著（P＜0.05），拌醅酒精度（A）和火醅接種量（B）的交互作用對總酸含量影響不顯著（P＞0.05），火醅接種量（B）和醋醅水分含量（C）的交互作用對總酸含量影響不顯著（P＞0.05）。

圖5 各因素交互作用對總酸含量影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between various factors on total acid contents

2.3 蕎麥醋醋酸發酵工藝優化驗證試驗

通過Design-Expert 10.0.7軟件對模型優化求解，得到蕎麥醋醋酸發酵的最佳工藝條件為：拌醅酒精度4.488%vol、火醅接種量11.716%、醋醅水分含量64.920%，此條件下蕎麥醋總酸含量理論值為4.900 g/100 mL。為驗證試驗結果的可靠性，考慮到實際的操作情況，將醋酸發酵工藝條件調整為拌醅酒精度4.50%vol、火醅接種量12%、醋醅水分含量65%，在此最佳醋酸發酵工藝條件下進行3次驗證試驗，得到蕎麥醋總酸含量實際平均值為4.86 g/100 mL，試驗結果與預測值偏差很小。因此，采用響應面法優化蕎麥醋醋酸發酵工藝條件得到的結果準確可靠，具有可行性。

3 結論

本試驗研究了蕎麥醋醋酸發酵工藝條件，通過單因素試驗和響應面法優化得到最佳工藝參數為：拌醅酒精度4.50%vol、火醅接種量12%、醋醅水分含量65%、發酵時間9 d。在此條件下，蕎麥醋總酸含量為4.86 g/100 mL。本研究為企業蕎麥醋產品的生產提供了技術指導，具有實際應用價值。