黑茶桑葉固體飲料對高脂飲食小鼠的減肥作用

湯荃荃，湛 莉，張梓瑩，石 昱，滕建造，劉子龍，劉仲華，張 盛*

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128；4.湖南艾嘉生物科技有限公司，湖南 瀏陽 410301）

當前社會高脂飲食（high-fat diet，HFD）導致了超重、肥胖等一系列問題出現，與肥胖相關的高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等慢性疾病的發病率逐年上升[1]。飲食干預是治療肥胖的重要非藥物手段，從我國豐富的天然產物資源中篩選具有降脂減肥作用的膳食功能因子，開發固體飲料或者功能食品，從而干預肥胖的發展成為重要的飲食發展趨勢。

黑茶作為我國特有的后發酵茶，從難以控制各種因素自然發酵，現已發展為可人工接種已知優勢菌群如青霉、毛霉、冠突散囊菌屬（Eurotium cristatum）等[2-3]，從而發揮各類黑茶的特征及優勢。屠幼英等[4]研究表明，發酵茶可對人體多種消化酶活性及腸道內微生物進行正向調節。在細胞培養、動物模型和人群臨床實驗中，黑茶均表現出良好的調節代謝綜合征[5]及腸道菌群[3，6]等功能，被認為具有顯著的減脂減肥功效。同時，茶葉中所含的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中含量最高的兒茶素單體[7-8]，可通過調節食欲[9]，影響棕色脂肪組織活性[10]，抑制脂肪細胞增殖分化[11]與脂滴積累[12]等多個途徑減輕體質量降低體脂；茶黃素（theaflavins，TF）是紅茶發酵過程中兒茶素進一步氧化產物，研究表明，茶黃素可有效抑制脂肪酸的積累[13]，抑制脂肪酶表達[14]，與茶紅素、茶褐素聯用還可正向調節試驗動物的腸道菌群構成[6]，從多個方面輔助降脂減肥。

桑葉早在2002年被國家衛生部法監司列為新資源食品，成為藥食同源的天然植物。其主要活性成分桑葉黃酮、桑葉多糖、1-脫氧野尻霉素（1-deoxyrijimycin，DNJ）等，通過抑制脂肪酶[15]、糖苷酶[16]、增加脂聯素抑制脂質過氧化[17]等途徑減少脂肪合成，加速脂肪代謝，同時調節腸道菌群[18]，從而達到降脂減肥效果。研究表明，發酵桑葉茶與未發酵桑葉茶相比，其DNJ含量與水浸出率都大幅提升[19]，通過添加適當的菌種可減少發酵桑葉的營養成分流失[20]。

我國為茶葉與桑葉種植大國，充分開發兩者資源及其他功能成分進行降脂減肥產品的開發，對振興鄉村經濟具有非常重要的意義，也對廣大肥胖患者是福音。本試驗擬通過喂養HFD小鼠建立高脂飲食肥胖模型，模擬人體因在日常飲食中攝入的脂肪含量過高造成的一種單純性肥胖，進一步通過動物試驗研究該固體飲料對HFD小鼠的減肥效果，并初步解析其作用機制，為后續開發功能性固體飲料提供理論支撐，同時也為解決茶葉等農產品的產能過剩問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

黑茶提取物、桑葉提取物、茶黃素（含量＞50%）、EGCG（含量＞98%）（均為分析純）：湖南艾嘉生物科技有限公司；16S rDNA V3-V4（a）區通用引物：由上海派森諾生物科技有限公司合成；輕身消胖丸：北京同仁堂國藥有限公司；正常飼料（型號XTCON50J）、60%高脂飼料（型號XTHF60）：江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒：山東博科生物產業有限公司。

1.1.2 試驗動物

雄性C57BL/6J小鼠，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，體質量18～20 g，由湖南斯萊克景達試驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2019-0004。所有動物實驗均經湖南農業大學生物醫學研究倫理委員會批準[批準號：倫審科2021第（96）號]。動物飼養于湖南農業大學茶葉研究所動物房，飼養環境條件為潔凈環境，溫度（24±2）℃，相對濕度45%～65%，定時照明（9：00～21：00）。

1.2 儀器與設備

KZ-II型高速組織研磨儀、MX-F型渦旋混合器：武漢賽維爾生物科技有限公司；D3024R型臺式高速冷凍離心機：北京大龍興創實驗儀器股份公司；Epoch酶標檢測儀：美國BioTeK公司；BK280型全自動生化分析儀：山東博科生物產業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑茶桑葉固體飲料制作工藝與操作要點

黑茶提取物制備操作要點：

粉碎：取黑茶原料粉碎，過10目篩網去除細粉。

提取：稱量粉碎后的黑茶原料100 kg，加入1 000 kg已經預加熱至75～80 ℃的純水，開始提取計時60 min，第一次提取液抽濾過200目篩網，再加入1 000 kg預加熱純水提取60 min，合并兩次提取過濾溶液。

濃縮：提取液在抽真空（-0.08～-0.095 MPa）狀態下加熱至55～65 ℃濃縮至固形物含量約為40%。

噴霧干燥：采用LPG50型離心噴霧干燥塔，進風溫度165 ℃，出風溫度80 ℃，霧化電機頻率300～400 Hz，進料頻率25 Hz。收集噴霧粉末過80目篩，得到黑茶提取物11.27 kg，水分含量2.30%。

桑葉提取物制備操作要點：

原料粉碎、提取、濃縮以及噴霧干燥均與黑茶提取物工藝保持一致，100 kg桑葉原料提取得到桑葉提取物15.33 kg，水分含量2.71%。

混合：按比例（20∶20∶3∶3）分別稱取黑茶提取物、桑葉提取物、98%EGCG和50%茶黃素，在錐形混合機中充分混勻30 min，得到黑茶桑葉固體飲料成品。

1.3.2 動物分組及模型建立

根據《保健食品功能評價指導原則（2020年版）（征求意見稿）減肥功能評價方法》（以下簡稱《方法》），所有小鼠適應性喂養3 d后，隨機分為2組：8只給予正常飼料的空白組（CK），52只給予60%高脂飼料的高脂飲食組，飼料基本成分對比見表1。

表1 正常飼料及高脂飼料基本成分對比Table 1 Comparisons of basal components between control and high-fat diet%

篩選期2周：為保證肥胖模型建立，喂養2周后排除高脂飲食組中體質量靠后的12只小鼠。建模期4周：將篩選剩余的40只小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為模型組（MG）、低劑量（L）組、中劑量（M）組、高劑量（H）組、陽性藥組（PG），繼續給予高脂飼料。

1.3.3 小鼠灌胃劑量設計及喂養

灌胃期6周：由成人（60 kg）每日推薦飲用干茶9 g[21]，得出推薦飲用量為150 mg/kg體質量，根據《方法》建議，以其5倍、10倍、15倍分別為低、中、高濃度的固體飲料對HFD小鼠進行灌胃；陽性藥物選用市售具減肥功效的中成藥，按照說明書成人每日服用60粒（總質量9 g），據實驗動物用藥量換算[22]后得到陽性藥物灌胃劑量=150 mg/kg體質量×9.1=1 365 mg/kg體質量；CK組及MG組灌胃蒸餾水作為對照。各組小鼠喂養及灌胃內容見表2。

表2 小鼠的喂養及灌胃Table 2 Feeding and intragastrical administration of mice

1.3.4 小鼠血清、糞便及器官等樣品的采集

灌胃期結束后，每組隨機選取6只小鼠，收集2～3顆糞便保存至2 mL無菌凍存管中，于-80 ℃備用。禁食12 h，次日用戊巴比妥鈉水溶劑麻醉后進行眼球取血，靜置2～4 h后，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，取上層血清保存在-80 ℃待測。小鼠斷頸處死后，取其肝臟、附睪脂肪，于預冷的生理鹽水中漂洗除去附著的血液，濾紙吸干后稱質量，所得肝臟組織一份用4%多聚甲醛固定，附睪脂肪組織一份用脂肪固定液進行固定，其余-80 ℃保存備用。

1.3.5 小鼠血清血脂水平檢測

按照試劑盒說明，測定小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.3.6 小鼠肝臟組織及脂肪組織病理學觀察

將小鼠肝臟和附睪脂肪組織送往武漢皮諾飛生物科技有限公司，制成石蠟切片并采用蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色方法，于光鏡下觀察肝臟及脂肪組織病理變化。

1.3.7 小鼠腸道菌群檢測

將保存于2 mL無菌離心管中的小鼠糞便，采用干冰送樣方法，寄送至上海派森諾生物科技有限公司。通過對通過質檢的樣品進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，以Illumina 為測序平臺建庫及測序，對其16S rDNA V3-V4（a）區腸道菌群進行α-多樣性、β-多樣性及基于門、屬水平物種構成分析。

1.3.8 數據處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析并作圖，試驗數據均以“平均值±標準差”（）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質量變化趨勢及增量

從建模期到灌胃期共計10周，對各組小鼠體質量進行記錄并分析，結果見圖1。

圖1 不同處理組小鼠體質量變化Fig.1 Body mass change of mice in different treatment groups

由圖1A可知，CK組體質量變化趨勢較為平穩，MG組體質量一直保持上升趨勢，其他各組體質量增幅均在給藥后的第5周表現出下降趨勢。從造模期開始到給藥期結束，對不同處理組小鼠體質量增加情況進行分析（圖1B）。與CK組比較，MG組體質量極顯著增加163%（P＜0.01），各劑量黑茶桑葉固體飲料組和PG組體質量增量均與CK組無顯著差異（P＞0.05），屬于正常體質量增長；同時，與MG組比較，各組體質量增量均表現出極顯著降低（P＜0.01），L、M、H組分別減少66%、73%、78%，均優于陽性藥組減少38%的減體質量效果。結果說明該固體飲料在本試驗劑量范圍內能有效控制高脂飲食小鼠的體質量增量，且效果隨著濃度增加而增強。

2.2 小鼠脂肪含量及脂肪細胞形態觀察

對各組小鼠的附睪脂肪進行稱量后得到脂肪濕質量，結果見圖2。

圖2 不同處理組小鼠脂肪濕質量及比重Fig.2 Wet mass and proportions of fat of mice in different treatment groups

由圖2A可知，與CK組相比，MG組小鼠附睪部位脂肪質量增加382%；對HFD小鼠進行不同濃度固體飲料灌胃后，各組脂肪濕質量均表現出顯著減少情況（P＜0.05），L、M、H組及PG組分別減少42%、58%、65%和26%，其中M、H組與CK組無顯著差異（P＞0.05）。圖2B為小鼠附睪脂肪質量在體質量中的占比，可見CK組小鼠脂肪比例為1.50%，在MG組中這一比值上升到4.98%。通過黑茶桑葉固體飲料灌胃，L、M、H組分別降至3.62%、2.47%和2.25%（P＜0.01），PG組降低為4.15%（P＜0.05），M組、H組與CK組無顯著差異（P＞0.05）。上述結果說明本試驗劑量范圍內，通過黑茶桑葉固體飲料灌胃可顯著減少小鼠體內的附睪脂肪含量，且其在中、高劑量下可將脂肪含量控制在正常范圍。

為進一步觀察小鼠脂肪組織的形態變化，對各組小鼠的附睪脂肪組織進行石蠟切片并染色，結果見圖3。由圖3可知，CK組脂肪組織的細胞形態規則，排列整齊緊密；MG組小鼠脂肪細胞呈無序狀排列，細胞出現充脂和體積增大，呈現不同程度的分化。通過灌胃黑茶桑葉固體飲料及陽性藥，該情況得到不同程度的改善：L組細胞呈圓形，但細胞體積仍有膨大情況；M組較細胞體積減小，排列較為緊密有序；H組細胞形態接近CK組，比PG組排列更為緊密，同視野下細胞數目更多，故細胞體積更小。

圖3 不同處理組小鼠腎周脂肪切片（×40）Fig.3 Perirenal fat section of mice in different treatment groups (×40)

由上述結果可知，固體飲料可有效抑制HFD小鼠附睪脂肪比重增加，其效果略優于所選陽性藥物且呈劑量依賴趨勢，同時能改善HFD小鼠附睪脂肪組織細胞的體積增大，抑制脂肪細胞變性，進而減輕肥胖給機體帶來的不良影響。

2.3 小鼠血清及血脂水平變化

為研究黑茶桑葉固體飲料對HFD小鼠血脂水平的影響，對不同處理組小鼠血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平進行測定，結果見圖4。

圖4 不同處理組小鼠血清甘油三酯（A）、總膽固醇（B）、低密度脂蛋白膽固醇（C）、高密度脂蛋白膽固醇（D）的含量Fig.4 Concentrations of triglyceride (A),total cholesterol (B),low-density lipoprotein cholesterol (C) and high-density lipoprotein (D)cholesterol in serum of mice in different treatment groups

由圖4可知，與CK組相比，MG組的TC水平極顯著上升（P＜0.01），TG、LDL-C、HDL-C水平均顯著上升（P＜0.05），說明高脂飲食會明顯增加小鼠血清血脂水平。與MG組相比較，L組的TG和LDL-C水平分別呈顯著（P＜0.05）和極顯著下降（P＜0.01），TC水平未見明顯下調；M組的TC、TG、LDL-C水平均為顯著下降（P＜0.05）；在H組中TC、TG、LDL-C的降幅達到極顯著水平（P＜0.01）。PG組對TC的升高起到極顯著抑制作用（P＜0.01），對其他指標影響不明顯。HDL-C水平僅在CK和MG組間產生明顯差異，且各組水平較為接近，考慮是受其他因素影響。上述結果說明高脂飲食造成了小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的升高，而通過不同濃度固體飲料干預，可以在不同程度上控制小鼠血清中TC、TG、LDL-C的增加，起到降血脂的作用。

2.4 小鼠肝臟組織病理學觀察

對各組小鼠的肝組織切片進行HE染色，結果見圖5。由圖5可知，觀察到正常飲食小鼠肝細胞大小均勻，排布整齊，肝竇排列有序，未見脂滴。高脂飲食小鼠肝細胞內有大量脂滴聚集，肝竇紊亂，出現空泡，肝臟細胞結構不全。陽性藥組小鼠肝臟細胞狀況改善明顯，細胞排列較為整齊。通過固體飲料灌胃，L組小鼠肝臟組織中脂滴聚集及空泡情況較MG組明顯減少，存在一定數量脂滴；M組肝組織切片顯著改善，細胞內有少量小脂滴，肝竇排列清晰有序；H組未見明顯脂滴，肝細胞排布均勻，接近于CK組。

圖5 不同處理組小鼠肝臟組織切片（×40）Fig.5 Liver tissue sections of mice in different treatment groups（×40）

2.5 小鼠腸道菌群多樣性分析

2.5.1 各處理組樣品物種豐度分析

對樣本量的飽和情況進行分析后作稀釋曲線，結果見圖6。由圖6可知，隨著測序數的增加，曲線越平緩，豐度減少趨勢趨于平穩，表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續增加測序深度已無法檢測大量尚未發現的新物種數目，樣本測序量基本已覆蓋所有類群，具有較高的可信度。

圖6 各處理組樣品稀釋曲線Fig.6 Dilution curves of each treatment group samples

2.5.2 各處理組小鼠腸道菌群Alpha分析

主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）是一種數據降維分析方法，用于將多維的數據轉換為距離矩陣，研究數據間的相似性。經過6周固體飲料的干預，試驗組腸道菌群組成結構發生了一定的偏移，結果見圖7。由圖7可知，MG組與CK組大部分位于第一主成分的異側，說明高脂飲食導致HFD小鼠與正常飲食組小鼠的腸道菌群產生較大差異；L、M、H組與MG組位于第二主成分的異側，說明給予干預的三組小鼠與高脂飲食模型小鼠的腸道菌群組成差異較大。L、M、H組大部分位于第一主成分的同側，說明給予干預的三組高脂小鼠具有相似的腸道菌群構成。

圖7 各處理組小鼠腸道菌群主坐標分析Fig.7 Principal coordinates analysis of intestinal flora of mice in each treatment group

2.5.3 各處理組小鼠腸道菌群構成分析

（1）腸道菌群在門水平上的組成

對各組小鼠腸道菌群在門水平上的組成進行分析，結果見圖8。結果表明，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides）是六個處理組中占比最高的三大菌門，所占比例之和均超過80%。CK組的Firmicutes相對豐度為66.12%，除M組略升至68.63%，其他各組的Firmicutes相對豐度都表現為下降（P＞0.05）；同時在CK組中占比19.09%的Bacteroidetes在MG組中大幅減少至2.91%（P＜0.01），而在L、M、H組中回升至12%以上，在PG組中回升到4.51%。較之CK組，MG組Proteobacteria相對豐度顯著增加（P＜0.01），L、M、H組Proteobacteria相對豐度下降（P＞0.05）。此外，CK組放線菌門（Actinobacteria）相對豐度達到11.08%，MG組僅占0.29%，與在固體飲料干預后，L、M、H組該菌門的相對豐度較之MG組稍有上升（P＞0.05）。疣微菌門（Verrucomicrobia）在M和H組中分別占5.18%和6.46%，而這一菌門在CK組中僅占0.21%，在MG和PG組中未檢測到。

圖8 各處理組腸道菌群在門水平上的相對豐度Fig.8 Relative abundance of intestinal flora in each treatment group at phylum level

Firmicutes包括較多革蘭氏陽性細菌，可能會吸收更多熱量從而導致肥胖[23]，Bacteroides可將人體腸道內多糖進行吸收和降解[24]。Proteobacteria相對豐度增加是腸道內平衡失調的標志，同時也提示疾病的發生[25]。Verrucomicrobia在肥胖兒童和代謝綜合征小鼠中該菌群的相對豐度均顯著低于正常組[26-27]。Actinobacteria是一種革蘭氏陽性菌，該菌群包括對人體有益的Bifidobacterium和可以用于開發抗生素的鏈霉菌（Streptomyces）等[28]，長期飼喂高脂飼料會導致腸道內Actinobacteria相對豐度水平降低[29]。在本試驗中，經過固體飲料干預，HFD小鼠腸道中與肥胖發生呈正相關的菌門相對豐度下調，而與肥胖呈負相關的菌門相對豐度下降，與上述研究結論有相似之處。（2）腸道內厚壁菌門與擬桿菌門比

分析各組厚壁菌門與擬桿菌門的比值（Firmicutes to bacteroides ratio，F/B值）結果見表3。結果表明，MG組顯著高于CK組（P＜0.05），較之模型組其他各處理組F/B值均顯著下降（P＜0.05），且與空白組無顯著差異（P＞0.05）。根據前人的研究，在高脂飲食所誘導的肥胖中，厚壁菌門的豐度與之呈正相關，而擬桿菌門與之呈反向關系[30-31]，因此肥胖也將帶來F/B值的增高[32]，這與本試驗所得結果相符。

表3 小鼠腸道內厚壁菌門與擬桿菌門比值Table 3 Ratio of Firmicutes to Bacteroides in the intestines of mice

（3）腸道菌群在屬水平上的組成

對各組小鼠腸道菌群在屬水平相對豐度進行分析，結果見圖9。結果表明，在CK組中表達量較低的菌群在MG組中表達量較高的有：Mucispirillum、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、顫螺菌屬（Oscillospira）等；在CK組中表達較高而在MG組中表達較低的有：異桿菌屬（Allobaculum）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。M組、H組與MG組區別較大，而CK組組成較為類似，其中H組擬桿菌屬（Bacteroides）、Parabacteroides、志賀菌屬（Shigella）等相對豐度較高。L組與MG組組成相近，但MG組中可能致病的Ruminococcus相對豐度在L組中已得到下調。在本試驗的六個處理組中，MG組與PG組腸道菌群在屬水平上的組成最為相近。

圖9 各組小鼠腸道菌群在屬水平上相對豐度熱圖Fig.9 Heat map of relative abundance of intestinal flora in each group at genus level

嗜黏蛋白艾克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）是一種于發現于2004年的益生菌[33]，可發揮保護腸道屏障，減輕炎癥的作用[34]。乳桿菌屬中包含多種乳酸桿菌，也屬于腸道中的有益菌種，可保護腸道免疫系統，抵御因肥胖造成的腸道菌群紊亂。在本試驗固體飲料的干預下，L、M、H組的AKK菌屬和乳桿菌屬等有益菌屬相對豐度較MG組得到明顯上調。

上述結果表明，本固體飲料可通過調節高脂飲食小鼠腸道微生物在門、屬等生物學水平的構成，提高腸道菌群多樣性，通過減少致病菌屬占比、回調有益菌屬豐度、降低F/B比值等方式，保護腸道菌群平衡，減輕炎癥發生，達到減肥功效。

3 結論

本研究通過對HFD小鼠進行低、中、高劑量黑茶桑葉固體飲料的灌胃，對比正常組、模型組和陽性藥組，從多個方面探究了該黑茶桑葉固體飲料對高脂飲食小鼠的減肥作用。通過對比正常組，發現高脂飲食小鼠的體質量、脂肪組織濕質量均顯著增加，TC、TG、LDL-C水平明顯上升，肝臟細胞中出現大脂滴，脂肪組織細胞膨大；給藥干預后的HFD小鼠，對比HFD模型組，其體質量的增量和脂肪濕重均明顯減少，TC、TG、LDL-C水平得到顯著改善，肝臟及脂肪組織細胞的變性得到緩解，其中以高濃度黑茶桑葉固體飲料的效果最佳。

對各組小鼠的腸道菌群進行測序分析，發現高脂飲食會造成腸道菌群比例失調，其中以厚壁菌門占比增加、擬桿菌門占比減少導致的F/B比值增加為主，而這個比值正是肥胖的標志之一；在低、中、高劑量固體飲料干預后，HFD小鼠腸道內F/B值均與正常組小鼠無異，還改善了因高脂飲食導致的其他菌屬水平紊亂。故本黑茶桑葉固體飲料可能通過調節腸道微生物環境的平衡，利用腸道菌群對人體的雙向調節作用，從而發揮減肥的功效，且在本試驗劑量范圍，其減肥效果隨著濃度的增加而增強。該固體飲料具體通過何種機制調節HFD小鼠腸道菌群達到降脂減肥作用，仍需深入探究，以進一步提高和清晰解析其減肥效果及作用機理。