葡萄糯米香醋發酵工藝的優化

祁勇剛，龔元元，胡 勇，胡東彬，高 冰，汪 超*

（1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.武漢市鑫宏食品釀造科研所，湖北 武漢 430051；3.鎮江丹和醋業有限公司，江蘇 鎮江 212362）

我國為食醋生產和消費大國，誕生了山西老陳醋、鎮江香醋、保寧麩曲醋、紅曲醋四大名醋，區別于其他國家的蘋果醋、香酯醋、雪梨醋、黑醋[1-3]，大部分食醋采用傳統固態發酵方式，以大曲、藥曲或麥曲為糖化發酵劑，通過開放式的發酵工藝，釀造了色香味俱佳的調味佳品[4-5]。由于開放式的生產工藝、復雜的原料種類、乙醇和乙酸轉化率低的原因，導致原料利用率低、發酵周期長、勞動強度大[6-7]。而液態發酵方式快速釀造食醋具有原料利用率高、生產周期短、自動化程度高的優點，逐漸為我國企業所接受，但其釀造的食醋有機酸單一、刺激性強、風味差，因此提升食醋生產效率和品質成為研究熱點[7-9]。隨著人民生活水平的提高，消費者對醋的要求不僅僅是一種調味品，而是一種集營養、功能、風味于一體的果糧復合飲用醋。目前已有關于果糧釀醋的研究報道，王榮榮等[10]以燕麥和蘋果為原料，制備的果糧醋具有較高的抗氧化性；蘇佳等[11]研究了利用水果刺梨、野木瓜與大米、馬鈴薯組合釀造果糧醋，發現刺梨與大米糖化液以1∶2混合，制備的醋產品具有明顯刺梨果香的果糧醋；全亮等[12]研究了蘋果甘薯復合果糧醋，制備兼具雙原料特征的風味醋。

葡萄因其糖分高，含有蘋果酸、琥珀酸、酒石酸等多種有機酸，常被用來釀造果酒和果醋[13-14]。糯米支鏈淀粉含量高、易糊化和糖化，經釀造微生物作用后殘留一定量的糊精而使得食醋的濃甜適口、酸味柔和，成為鎮江香醋的主要釀醋原料[15-16]。

本研究以葡萄和糯米為原料，制備葡萄糯米香醋，以酒精度和感官評分為評價指標，采用正交試驗設計優化其酒精發酵條件；以總酸含量和感官評分為評價指標，優化其醋酸發酵工藝條件，并對該產品揮發性成分、理化指標及感官品質進行分析。以期制備一種兼具葡萄果醋和糯米醋優點、具有葡萄果香氣和酸甜宜人的果糧復合飲用香醋，為葡萄糯米果糧香醋工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

糯米：鎮江丹和醋業有限公司；赤霞珠葡萄（糖度為25%）：湖北省丹江口武當生物工程有限公司；黃酒高活性干酵母、葡萄酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）RV002：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（Acetobacter aceti）AS1.01：廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

白砂糖：市售；耐高溫α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10萬U/g）、果膠酶（500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、無水乙醇、氯化鈉、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

醋酸菌活化培養基：0.1g/L葡萄糖、0.1g/L酵母膏、0.2g/L瓊脂，115 ℃滅菌15 min后冷卻至50 ℃加入體積分數3%的乙醇。

醋酸菌液體種子培養基：0.1 g/L葡萄糖、0.1 g/L酵母膏、115 ℃滅菌15 min后冷卻至50 ℃加入體積分數4%的乙醇。

1.2 儀器與設備

SPME手動進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；7890A/5975C氣相色譜-質譜（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）聯用儀、DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；PC-420磁力恒溫攪拌器：美國Corning公司；NAR-3T愛拓阿貝折光儀：廣州市愛宕科學儀器有限公司；MSF-S-50L自動型機械攪拌罐：南京匯科生物工程設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糯米香醋加工工藝流程及操作要點

操作要點：

葡萄漿液的制備：挑選無霉爛的葡萄，去梗、清洗，榨汁機破碎、打漿，加入0.5%的果膠酶，40 ℃保溫酶解2 h，得到葡萄漿液。

糯米糖化醪的制備：以糯米∶水（1∶4）的質量比加飲用水，加熱至100 ℃，常壓蒸煮20 min后，90～95 ℃保溫，加入0.05%耐高溫α-淀粉酶，保溫15 min后降溫至65 ℃，加入0.2%糖化酶，62～65 ℃保溫4 h后，得到糯米糖化醪，迅速降溫至40 ℃。

混合調配：根據葡萄與糯米的質量比，計算葡萄漿液和糯米糖化醪的混合比例為2∶5，攪拌均勻，用飲用水或白砂糖調整糖度為18%。

酒精發酵：取葡萄質量0.2%的葡萄酒高活性干酵母，葡萄酒高活性干酵母與2%的葡萄糖水按1∶5的質量比混合均勻，在37 ℃的水浴鍋中活化20 min，活化好的葡萄酒高活性干酵母加入到調配好的糖化液中，30 ℃保溫發酵51 h，至酒精度不再上升，酒精發酵結束，陳釀48 h，得到酒醪。

醋酸發酵：取甘油管保藏的醋酸菌100 μL，涂布到醋酸菌活化培養基上，培養20 h后，取接種環挑取1個菌落，接入醋酸菌種子培養基中，三角瓶裝液量為50 mL/250 mL，轉速120 r/min、30 ℃培養17 h獲得醋酸菌種子液。對酒醪進行過濾除去果皮和米渣，加蒸煮5 min后的葡萄汁和飲用水調整酒精度。按5%的接種量加入醋酸菌種子液，三角瓶裝液量為100 mL/500 mL，120 r/min、30 ℃發酵72 h，至總酸不再升高，醋酸發酵結束。四層紗布過濾，蒸煮15 min，即得葡萄糯米香醋。

1.3.2 葡萄糯米香醋酒精發酵工藝優化

單因素試驗：以酒精度和感官評分為指標，分別考察葡萄與糯米的質量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），初始糖度（15%、17%、19%、21%、23%、25%），葡萄酒高活性干酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%），發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）對酒醪品質的影響。

正交試驗：以酒精度和感官評分為評價指標，以初始糖度（A）、葡萄酒高活性干酵母添加量（B）和發酵溫度（C）為影響因素，在單因素試驗的基礎上，用L9（34）正交試驗設計試驗，因素與水平見表1。

表1 酒精發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments of alcohol fermentation process optimization

1.3.3 葡萄糯米香醋醋酸發酵工藝優化

固定裝液量為100 mL/500 mL，轉速120 r/min，發酵時間為72 h，分別考察初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol）、醋酸菌接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）、發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）對總酸和感官評分的影響。

1.3.4 分析檢測

酒精度的測定：參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規定的方法。總酸、不揮發酸、還原糖、氨基酸態氮、可溶性固形物的測定：參考GB 18187—2000《釀造食醋》中規定的方法。總酯的測定：參考GB/T 19777—2013《地理標志產品山西老陳醋》中規定的方法。

1.3.5 揮發性成分的測定

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（He）（99.999%），進樣量5 μL，流量1 mL/min，不分流，進樣口溫度250 ℃；升溫程序起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min，再以25 ℃/min升溫至250 ℃。

質譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離方式電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃，掃描質量范圍33～450 amu。

定性、定量：通過與美國國家標準技術研究所（national instituteof standards and technology，NIST）14.0標準譜庫自動檢索各組分質譜數據，按照標準譜圖及保留指數對機檢結果進行定性，按峰面積歸一化法確定葡萄糯米香醋中各揮發性成分的相對含量。

1.3.6 感官評價

參考GB 15037—2006《葡萄酒》，以色澤（15分）、香氣（35分）、滋味（35分）和澄清程度（15分）作為感官評價項目，制定的酒醪上清液的感官評價標準見表2。

表2 酒醪的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of wine mash

參考GB/T 18623—2011《地理標志產品鎮江香醋》，以色澤（15分）、香氣（35分）、滋味（35分）和澄清程度（15分）作為感官評價項目，制定的葡萄糯米香醋的感官評價標準見表3。

表3 葡萄糯米香醋的感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standards of grape-glutinous rice aromatic vinegar

2 結果與分析

2.1 葡萄糯米香醋酒精發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 葡萄與糯米質量比的確定

糯米糖化發酵后殘留糊精和低聚糖較多，會使得釀造的醋口味濃甜、香氣佳，被用來釀造鎮江香醋[14]。葡萄含糖量高，其香氣成分種類多、含量高[17-18]。以葡萄和糯米為原料采用液態發酵釀造果糧香醋，酒精發酵的質量決定了醋的品質，其質量比將會影響酒醪的質量。葡萄與糯米質量比對酒醪品質的影響見圖1。

圖1 葡萄與糯米質量比對酒醪品質的影響Fig.1 Effect of mass ratio of grape and glutinous rice on wine mash

由圖1可知，葡萄與糯米質量比在1∶3～3∶1的范圍內增加，酒醪酒精度由9.3%vol逐漸升高到10.5%vol；隨著葡萄與糯米質量比在1∶3～2∶1范圍內的增加，酒醪的感官評分逐漸增加，當葡萄與糯米質量比達到2∶1時，其感官評分達到最大值，為76.8分，當葡萄與糯米質量比＞2∶1之后，其感官評分有所下降，這時酒醪刺激性較強、微苦，發酵性糖含量過低，殘存的糊精過少。另外，葡萄用量大會造成成本的增加，因此，葡萄與糯米的質量比為2∶1時較適宜。

2.1.2 初始糖度的確定

初始糖度對酒醪品質的影響見圖2。由圖2可知，隨著初始糖度在15%～25%范圍內的增大，酒醪酒精度由7.8%vol逐漸增加至10.8%vol，而當初始糖度＞21%時，酒精度增速減緩，這是由于糖度過高，影響了酵母的增殖和代謝活動[19]。當初始糖度在15%～23%范圍內的增加，酒醪感官評分逐漸增加，初始糖度為23%時，酒醪的感官評分最高，為79.7分，當初始糖度＞23%時，感官評分逐漸下降，其原因主要是由于殘糖過多，導致酒醪偏甜。考慮釀醋成本，因此，初始糖度為21%較適宜。

圖2 初始糖度對酒醪品質的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on wine mash

2.1.3 葡萄酒高活性干酵母添加量的確定

葡萄酒高活性干酵母添加量對酒醪品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著葡萄酒高活性干酵母添加量在0.05%～0.20%范圍內的增加，酒醪酒精度和感官評分均逐漸增加，當葡萄酒高活性干酵母添加量為0.20%時，酒精度及感官評分均達到最大值，分別為10.5%vol和77.9分，此時，當葡萄酒高活性干酵母添加量＞0.20%之后，酒精度及感官評分均下降。究其原因可能是，葡萄酒高活性干酵母接種量過小，酵母提前達到衰亡期[21]，造成糖轉化率下降，酒精度較低，同時殘糖較高會造成酒醪偏甜，影響感官評分；當酵母接種量過大時，酒精發酵過快，造成發酵性糖過度消耗，降低其轉化率，酒精度也會隨之降低，過多的酵母自溶物也會影響酒醪的滋味和體態[22]，降低了感官評分。因此，葡萄酒高活性干酵母的最適添加量為0.20%較適宜。

圖3 葡萄酒高活性干酵母添加量對酒醪品質的影響Fig.3 Effects of wine active dry yeast addition on quality of wine mash

2.1.4 發酵溫度的確定

發酵溫度對對酒醪品質的影響見圖4。由圖4可知，當發酵溫度在24～30 ℃范圍內的增加，酒精度及感官評分均上升，當發酵溫度為30 ℃時，均達到最大值，此時，酒精度為10.5%vol，感官評分為79.4分，當發酵溫度＞30 ℃之后，酒精度及感官評分均下降。因此，發酵溫度為30 ℃較適宜。

圖4 發酵溫度對酒醪品質的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on wine mash

2.1.5 葡萄糯米香醋酒精發酵工藝正交試驗優化結果

根據酒精發酵單因素試驗結果，以酒精度和感官評分為評價指標，選取初始糖度（A）、葡萄酒高活性干酵母添加量（B）和發酵溫度（C）3個因素進行正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表4，方差分析見表5。

表4 酒精發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments of alcohol fermentation process optimization

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results

續表

由表5可知，根據F值，影響酒醪酒精度的主次因素為：初始糖度＞葡萄酒高活性干酵母添加量＞發酵溫度，其最佳條件為A3B3C2；影響其感官評分的主次因素為：初始糖度＞葡萄酒高活性干酵母添加量>發酵溫度，其最佳條件為A3B3C1。由表5亦可知，初始糖度對酒醪酒精度有極顯著影響（P＜0.01），葡萄酒高活性干酵母添加量對其有顯著影響（P＜0.05），發酵溫度影響不顯著（P＞0.05）；初始糖度對感官評分有極顯著影響（P＜0.01），而葡萄酒高活性干酵母添加量對其有顯著影響（P＜0.05），發酵溫度影響不顯著（P＞0.05）。

對于多個考核指標采用綜合平衡法確定優方案，初始糖度和葡萄酒高活性干酵母添加量對酒精度和感官評分的影響一致，選A3B3，發酵溫度對感官評分影響不顯著，因此從節約能源的角度選C1，最后得出最優方案為A3B3C1。最優方案未出現在試驗組，因此將最優方案與試驗組A3B3C2進行驗證，結果表明，二者酒醪酒精度分別為10.6%vol和10.4%vol，感官評分分別為82.8分和83.5分，結合酒醪的香氣和滋味，綜合考量能源節約問題，選取最優方案效果更佳，即初始糖度23%、葡萄酒高活性干酵母添加量0.22%、發酵溫度28 ℃。

2.2 葡萄糯米香醋醋酸發酵工藝優化

2.2.1 初始酒精度的確定

液態醋酸發酵啟動需要一定的總酸含量，葡萄中含有多種有機酸，為其啟動發酵提供了底酸，同時酒醪酒精度過高也會抑制醋酸菌增殖與代謝，產酸緩慢，甚至不產酸[23]。因此，考察初始酒精度對葡萄糯米香醋品質的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著初始酒精度由5%vol增大至7%vol，感官評分逐漸增加，當初始酒精度為7%vol時，感官評分達到最大值，為82.4分，當初始酒精度＞7%vol，感官評分逐漸下降；隨著初始酒精度在5%vol～8%vol范圍內的增加，總酸含量逐漸增加，初始酒精度為8%vol時，總酸最高，為5.21 g/100 mL，當初始酒精度＞8%vol，而總酸含量快速下降。究其原因可能是，過高的酒精度抑制了醋酸菌的增殖和代謝，導致產酸緩慢，未轉化的酒精和過低的總酸導致醋的滋味差，感官品質下降。因此，最適初始酒精度為7%vol。

圖5 初始酒精度對葡萄糯米香醋品質的影響Fig.5 Effect of initial alcohol content on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar

2.2.2 醋酸菌接種量的確定

醋酸菌接種量對葡萄糯米香醋品質的影響見圖6。由圖6可知，隨著醋酸菌接種量在3%～5%范圍內增加，總酸含量及感官評分均呈上升趨勢，當在醋酸菌接種量為5%時，均達到最大值，總酸含量為4.69 g/100 mL，感官評分為83.2分，醋酸菌接種量＞5%，兩者均下降。其原因可能是，接種量過大，導致醋酸菌競爭性抑制，過度消耗乙醇，進而導致總酸轉化率降低，糖酸比例不協調，過量的醋酸菌自溶也會影響醋汁的滋味和渾濁度[24]。因此，最適醋酸菌接種量為5%。

圖6 醋酸菌接種量對葡萄糯米香醋品質的影響Fig.6 Effect of Acetobacter aceti inoculum on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar

2.2.3 發酵溫度的確定

過低的溫度會導致醋酸發酵無法啟動，使得發酵液易染雜菌而失敗[25]。因此，考察發酵溫度對葡萄糯米香醋醋品質的影響，結果見圖7。由圖7可知，隨著溫度在24～30 ℃范圍內的升高，總酸含量及感官評分均增加，當發酵溫度為30 ℃時，總酸含量及感官評分達到最高值，分別為4.71 g/100 mL、84.3分，當發酵溫度高于30 ℃，總酸含量及感官評分均下降。因此，最適發酵溫度為30 ℃。

圖7 發酵溫度對葡萄糯米香醋品質的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar

因此，確定最佳的初始酒精度、醋酸菌接種量、發酵溫度分別為7%vol、5%、30 ℃。在上述的工藝條件下制備葡萄糯米香醋進行后續試驗。

2.3 葡萄糯米香醋品質評價

2.3.1 葡萄糯米香醋揮發性成分分析

按照優化后的工藝制備了葡萄糯米香醋，對其揮發性成分進行測定，結果見表6。

由表6可知，葡萄糯米香醋中共檢測出31種揮發性成分，其中醇類7種、醛類3種、酸類7種、酯類13種、苯類1種，分別占總揮發性成分的27.69%、9.18%、24.42%、34.48%、0.23%。醇類含量較多的物質為苯乙醇（12.67%）、3-甲基丁醇（8.84%）、2,3-丁二醇（5.93%），醛類含量較多的為糠醛（8.30%），酸類含量較多的為乙酸（17.59%）、苯甲酸（3.82%）、3-甲基丁酸（2.41%），酯類含量較多的為乙酸乙酯（10.64%）、丁二酸乙酯（7.25%）、乙酸苯乙酯（5.86%）、丁二酸二乙酯（4.19%）、己酸苯乙酯（2.27%）。

表6 葡萄糯米香醋揮發性成分的GC-MS分析結果Table 6 Results of volatile components of grape-glutinous rice aromatic vinegar analyzed by GC-MS

以葡萄和糯米為原料，經過葡萄酒酵母代謝產生了較多的苯乙醇、乙醇[26]，再經過醋酸發酵代謝的乙酸，混合葡萄原料中醇類、酸類和酯類等豐富的混合果香氣成分，醋酸發酵前添加蒸煮的葡萄汁和成品醋的蒸煮形成了焦甜香的糠醛[13，27]，進而形成了葡萄糯米香醋以乙酸、糠醛、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸乙酯、乙酸苯乙酯等酸類、醛類、醇類和酯類物質為主體的濃郁似葡萄、蘋果、菠蘿、蜂蜜等的混合果香。

2.3.2 葡萄糯米香醋理化指標和感官評價

葡萄糯米香醋的理化指標見表7。由表7可知，總酸、不揮發酸和還原糖的含量分別為4.70 g/100 mL、0.46 g/100 mL和3.24 g/100 mL。由于葡萄糯米香醋為液態發酵，發酵微生物單一，其代謝產生不揮發酸少，但由于在醋酸發酵前選用葡萄汁調配酒精度，增加了醋的不揮發酸和還原糖的含量，還有糯米發酵后殘留的糊精和低聚糖，提高了糖酸比和不揮發酸含量，降低了乙酸的刺激性，使酸味更柔和。相比于鎮江香醋和山西老陳醋，葡萄糯米香醋的總酯含量更高[28-29]，氨基酸態氮、可溶性固形物、總酯含量分別為0.28 g/L、9.64 g/100 mL、3.18 g/100 mL，達到了以葡萄與糯米為原料釀造具有濃郁酯香香醋的目標。制備葡萄糯米香醋，紅褐色、澄清透亮，口感醇厚、酸甜柔和，具有濃郁的果香和醋香氣。

表7 葡萄糯米香醋的理化指標Table 7 Physicochemical indexes of grape-glutinous rice aromatic vinegar

3 結論

本研究以葡萄和糯米為主要原料，以酒精度和感官評分為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗優化得到葡萄糯米香醋酒精發酵工藝條件為：葡萄與糯米質量比2∶1、初始糖度23%、葡萄酒高活性干酵母添加量0.22%、發酵溫度28 ℃；醋酸發酵工藝條件為：初始酒精度7%vol、醋酸菌接種量5%、發酵溫度30 ℃。在此優化條件下制備的葡萄糯米香醋共檢出31種揮發性成分，其中醇類7種、醛類3種、酸類7種、酯類13種、苯類1種，形成了以乙酸、糠醛、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸乙酯、乙酸苯乙酯為主體的濃郁混合果香氣。產品總酸含量達4.70 g/100 mL、總酯含量為3.18 g/100 mL，葡萄糯米香醋呈紅褐色、澄清透亮，口感醇厚、酸甜柔和。