B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期、淋巴結轉移的關系及對患者生存時間的預測*

李 強，黃思宇△，閔 倩，張洪濤，謝 猛

安徽省阜陽市第二人民醫院：1.腫瘤科；2.檢驗科，安徽阜陽 236015

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。該病每年的發病率約為17/10 000，嚴重影響了患者的健康和安全，并給患者家屬造成了巨大經濟負擔[1]。目前，胃癌的臨床療效不顯著，預后不良，尤其是進展期胃癌。盡管部分患者進行了根治性胃切除術，但5年生存率僅為20%左右，因此，對胃癌發病機制的研究有助于提高臨床療效和改善預后[2]。有研究發現，胃癌可由多種復雜的內、外因素引起，這些因素導致細胞結構破壞和基因表達異常，胃癌的發生和發展可能與多種癌基因和淋巴細胞(包括B細胞)的激活以及抑癌基因的失活有關[3]。另有研究發現，CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)屬于CD4+Treg亞群，與腫瘤免疫抑制有一定關系，其可以調節CD4+和CD8+的激活和增殖，并調節免疫應答[4]。目前，關于Treg與胃癌病理特征相關性的研究較少?；诖?，本文主要探討了B細胞、CD4+CD25+Treg的表達與胃癌患者TNM分期、淋巴結轉移的關系，并分析了上述細胞表達情況對患者預后生存時間的預測價值，旨在為臨床胃癌的診斷和治療提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月本院收治的胃癌患者80例作為胃癌組。納入標準：(1)通過胃鏡或病理檢查證實為胃癌；(2)入組前未進行放化療；(3)臨床資料完整；(4)所有患者均知情同意參與本研究；(5)均無認知障礙。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)凝血功能異常；(3)無法完成本研究所有檢查項目；(4)檢查結果無效；(5)中途退出研究。胃癌組中男52例，女28例；年齡35～75歲，平均(50.12±5.23)歲；腫瘤最大徑：≤5 cm共38例，>5 cm共42例；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期40例，Ⅳ期8例；分化程度：高分化13例，中分化23例，低分化44例；腫瘤位置：胃體41例，幽門及胃竇19例，賁門及胃底20例；病理類型均為胃腺癌，其中管狀腺癌33例，乳頭狀腺癌27例，黏液腺癌20例；發生淋巴結轉移52例，未發生淋巴結轉28例。選取同期在本院體檢的健康者50例作為對照組，其中男32例，女18例；年齡35～75歲，平均(51.03±6.02)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1B細胞水平的檢測 將正常胃組織和胃癌組織獲得的淋巴細胞調到2×109/L后進行離心，在試管中加入40 μL CD4+試劑和40 μL CD19+試劑，重懸，室溫下避光孵育15 min；磷酸鹽緩沖液洗滌后，用流式細胞儀檢測并用軟件分析。

1.2.2CD4+CD25+Treg比例的檢測 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血5 mL，肝素抗凝后，用梯度離心法分離淋巴細胞，用不含胎牛血清1640培養基洗滌兩次，然后用含1%胎牛血清的完全1640培養基進行重塑，接著將淋巴細胞計數并稀釋至1×106/mL，取1 mL細胞懸液于試管中，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，分別將20 μL異硫氨酸熒光素(FITC)標記的CD4抗體和20 μL熒光素PE標記的CD25抗體在4 ℃冰箱中暗孵30 min，然后離心，用1%胎牛血清蛋白-磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，稀釋至300 μL；用貝克曼庫爾特Gallios流式細胞儀(蘇州賽恩斯儀器有限公司)測定淋巴細胞表面各熒光素的熒光強度，并用空白和陰性對照消除非特異性和自發熒光。每次分析10 000個細胞，用二維dot-p1ot散點圖保存，在FITC-CD4/PE-CD25雙參數圖上計算CD4+CD25+Treg比例，CD4+CD25+Treg比例=CD4+CD25+Treg/CD4+Treg×100%。

1.3觀察指標 (1)比較兩組外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例；(2)比較不同TNM分期、淋巴結轉移的胃癌患者B細胞、CD4+CD25+Treg比例的差異；(3)分析B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期、淋巴結轉移的關系；(4)記錄所有胃癌患者隨訪的生存情況。所有患者隨訪3年，共失訪2例，胃癌組失訪1例，對照組失訪1例，失訪原因均為更換聯系方式或聯系方式錯誤。

2 結 果

2.1兩組外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例比較 胃癌組外周血B細胞水平低于對照組(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例比較

2.2不同TNM分期、淋巴結轉移的胃癌患者B細胞、CD4+CD25+Treg比例比較 不同TNM分期、淋巴結轉移的胃癌患者B細胞、CD4+CD25+Treg比例差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同TNM分期、淋巴結轉移的胃癌患者B細胞、CD4+CD25+Treg比例比較

2.3B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期的關系 以TNM分期(定義“Ⅰ期”=1，“Ⅱ期”=2，“Ⅲ期”=3，“Ⅳ期”=4)作為因變量，將不同TNM分期胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例作為自變量，納入多元線性回歸模型，結果顯示，胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期均存在相關性(P<0.05)，見表3。

表3 B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者TNM分期的關系

2.4B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者淋巴結轉移的關系 以淋巴結轉移(定義“是”=1，“否”=2)作為因變量，將不同淋巴結轉移胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例作為自變量，納入多元線性回歸模型，結果顯示，胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例與淋巴結轉移均存在相關性(P<0.05)，見表4。

表4 B細胞、CD4+CD25+Treg比例與胃癌患者淋巴結轉移的關系

2.5B細胞對胃癌患者生存時間的預測 隨訪半年，B細胞低表達患者有62例，平均生存時間為(24.06±5.13)個月；高表達患者17例，平均生存時間為(34.09±5.22)個月，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6CD4+CD25+Treg細胞對胃癌患者生存時間的預測 CD4+CD25+Treg細胞高表達患者60例，平均生存時間為(23.17±5.09)個月；低表達患者19例，平均生存時間為(35.12±5.07)個月，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

胃癌常發生在胃黏膜和胃腺上皮中。最常見的組織學類型是腺癌，發生在胃竇的小彎曲處[5]。近年來，雖然全世界胃癌患者的發病率和病死率呈緩慢下降趨勢，但由于國內人口老齡化較嚴重，新發胃癌患者數量仍居高不下，病死率仍處于我國疾病病死率的前列[6]。雖然約55%的胃癌患者在治療時僅表現為非特異性胃腸道消化不良，且在胃癌早期通常沒有明顯癥狀，大多數患者就診時已進展到胃癌晚期，只能通過徹底的淋巴結清掃進行保守治療[7]。晚期患者手術預后差，并發癥多，因此找到可預測其生存時間的指標對于降低患者的病死率具有十分重要的臨床意義。

B細胞作為體液免疫的重要介導細胞，主要在抗原刺激下分化為漿細胞，產生免疫球蛋白(Ig)，參與體液免疫[8]。有研究發現，被腫瘤組織浸潤的B細胞可以產生IgG抗體，識別腫瘤組織中的抗原并抑制其生長[9]。CD4+CD25+Treg是CD4+Treg亞群的成員，其可能導致機體免疫功能降低，以及白細胞介素-2水平升高，使抗CD3和抗CD28單克隆抗體的聯合作用處于無反應狀態。此外，其還具有免疫抑制作用，表現為在細胞抗原受體接收激活的信號刺激后，抑制CD4+和CD8+細胞的活化和增殖[10]。以往的研究發現，CD4+CD25+Treg在預防免疫性疾病、抑制神經系統疾病和腫瘤免疫反應中起著非常重要的作用[11]。其作用不依賴于細胞因子，而僅通過細胞間接觸[12-13]。目前，關于CD4+CD25+Treg與胃癌患者臨床特征的關系研究較少。探討其相關性有助于胃癌早期診斷、客觀評估病情，為臨床治療提供參考依據。

本研究結果顯示，胃癌組外周血B細胞水平低于對照組(P<0.05)，CD4+CD25+Treg比例高于對照組(P<0.05)；本研究結果還顯示，不同TNM分期、淋巴結轉移的胃癌患者B細胞、CD4+CD25+Treg比例差異均有統計學意義(P<0.05)；進一步分析發現，胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期、淋巴結轉移均存在相關性(P<0.05)，提示B細胞、CD4+CD25+Treg比例可對胃癌患者的TNM分期、淋巴結轉移產生一定的影響。相關研究結果顯示，在淋巴細胞性間質性胃癌中，B細胞高浸潤組分化程度較高，TNM分期較低；EB病毒(EBV)陰性淋巴細胞間質性胃癌中，B細胞高侵襲組TNM分期低于低侵襲組，提示B細胞可能有助于降低腫瘤TNM分期[14]。另有研究顯示，胃癌患者術前外周血CD4+CD25+Treg比例在不同TNM分期患者中差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例明顯高于Ⅰ期(P<0.05)，Ⅳ期胃癌患者外周血CD4+CD25+Treg比例也明顯高于Ⅱ期(P<0.05)，提示TNM分期越高，術前外周血CD4+CD25+Treg比例越高[15]。上述結果提示，在腫瘤進展過程中，外周血中CD4+CD25+Treg的水平增加，說明外周血CD4+CD25+Treg可能影響腫瘤的進展。另外，生存分析發現，不同B細胞、CD4+CD25+Treg比例的胃癌患者的生存時間差異有統計學意義(P<0.05)，提示B細胞、CD4+CD25+Treg可作為預測胃癌患者預后的指標。

綜上所述，胃癌患者的外周血B細胞水平降低，CD4+CD25+Treg比例增加，胃癌患者外周血B細胞、CD4+CD25+Treg比例與TNM分期、淋巴結轉移均存在相關性，外周血B細胞、CD4+CD25+Treg可作為預測胃癌患者預后情況的指標。