腎著湯對寒濕性腰腿痛小鼠模型的治療作用機制研究

孫秀玲，張靖涵

（1.山東中醫藥高等專科學校醫學系，山東煙臺 264199；2.濱州醫學院煙臺校區特殊教育學院，山東煙臺 264033）

腰腿痛是臨床常見腰腿部退行性疾病，以腰部疼痛并放射至下肢引起局部麻木疼痛為主要表現。近年來，隨著老齡化進程加快，腰腿痛發病率逐年上升[1]。腰腿痛發病機制復雜，與腰椎間盤突出、腰椎管狹窄、腰肌勞損等密切相關。目前，現代醫學對腰腿痛治療包括內治和外治方法，但內科中成藥藥物治療療效差異顯著，外科手術治療存在一定風險，且具有較嚴格的適應證和禁忌證，限制了臨床應用[2-3]。中醫學具有療效肯定、安全性高特點。近年來，隨著國家對中醫藥發展的重視，中醫藥在腰腿痛治療中的作用備受臨床關注[4]。寒濕性腰腿痛是臨床常見證型，腎著湯即甘姜苓術湯，出自《金匱要略》，既往已有報道將其用于腰椎間突出癥患者，對改善腰腿痛起到顯著效果[5]。本研究通過建立動物模型，進一步觀察其在寒濕性腰腿痛中的臨床效果和作用機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究30只實驗動物均為BALB/c清潔級健康小鼠[山東大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SCXK（魯）20090001]，雌雄各半。小鼠周齡10～12周，體質量16～20 g，平均體質量（18.35±1.62）g。小鼠均在自然光周期條件下飼養，控制室溫在20～22 ℃，相對濕度65%～70%，顆粒飼料和墊料均由山東中醫藥高等專科學校實驗中心提供。采用隨機數字表法將30只小鼠分為A組、B組和C組，每組10只。A組小鼠中雌性6只，雄性4只；周齡10～12周；體質量16～19 g，平均體質量（17.96±1.50）g。B組小鼠中雌性5只，雄性5只；周齡10～12周；體質量16～20 g，平均體質量（18.02±1.47）g。C組小鼠中雌性4只，雄性6只；周齡10～12周；體質量17～20 g，平均體質量（18.15±1.63）g。3組小鼠一般資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），組間具有可比性。本實驗經山東中醫藥高等專科學校動物實驗倫理審查批準。

1.2 研究方法 ①A、B兩組小鼠建模。建模方法：將小鼠放入500 mL燒杯中，燒杯倒入250 mL水，水溫＜12 ℃，浸泡30～90 min。觀察到小鼠腰腿不利、難以正常行走、渾身戰栗提示寒濕性腰腿痛建模成功。②干預方法。A組小鼠給予腎著湯干預，組方：甘草6 g、白術6 g、干姜12 g、茯苓12 g。中藥購自山東中醫藥高等專科學校附屬醫院中藥房，由中藥房煎制，每1 mL含生藥為0.18 g，制成真空包裝，低溫保存備用。按生藥1.8 g/kg計算劑量，灌胃，早晚各1次，連續干預3周。B組和C組小鼠給予常規喂養。③檢測方法。在腎著湯干預3周后記錄3組小鼠扭體潛伏期和扭體次數。采集小鼠腹主動脈血3 mL，采用臺式高速離心機[上海醫療器械集團有限公司，滬食藥監械(準)字2012第1410290號，型號：GL-18B型]對血液標本以3 000 r/min離心10 min，采用全自動血流變測試儀[上海涵飛醫療器械有限公司，京藥監械(準)字2012第2400319號，型號：ZL6000型]檢測血漿黏度，計算紅細胞聚集率和紅細胞變形指數。然后將小鼠全部處死，取小鼠豎脊肌組織，分別采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和免疫組化法檢測小鼠組織中血管內皮生長因子（VEGF）、增殖細胞核抗原（PCNA）及神經生長因子（NGF）相對表達量和蛋白表達水平，以β-actin為內參照以2-ΔΔCt法計算表示相對表達量。qRT-PCR引物設計見表1，反應條件：95 ℃預變性30 s、變性5 s，60 ℃退火40 s，循環40次。免疫組化（SP法染色）檢測結果判斷標準：以著色為細胞結果陽性，以著色面積表示陽性細胞，見表2。以兩項評分之和≥3分為結果陽性[6]。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 免疫組化結果判斷標準

1.3 觀察指標 ①比較3組小鼠干預后扭體潛伏期和扭體次數。②比較3組小鼠血漿黏度、血小板聚集率及紅細胞變形指數。③比較3組小鼠VEGF、PCNA及NGF相對表達量和陽性率。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗；計數資料以[例(%)]表示，組間比較行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠干預后扭體潛伏期和扭體次數比較 C組小鼠扭體潛伏期顯著長于A組和B組，扭體次數顯著少于A、B兩組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；A組小鼠扭體潛伏期長于B組，扭體次數少于B組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 3組小鼠干預后扭體潛伏期和扭體次數比較（x）

2.2 3組小鼠血液流變學水平比較 C組小鼠血小板聚集率和紅細胞變形指數均低于A、B兩組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；A組血漿黏度、血小板聚集率及紅細胞變形指數水平顯著低于B組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 3組小鼠血液流變學水平比較（x）

2.3 3組小鼠VEGF、PCNA及NGF表達水平比較 A組小鼠豎脊肌組織中NGF相對表達量和陽性率均顯著低于B組，VEGF和PCNA相對表達量和陽性率均高于B組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表5。

表5 3組小鼠VEGF、PCNA及NGF表達水平比較

3 討論

腰腿痛屬中醫痹癥范疇，其病位在腎。《景岳全書》明確記載，腰痛證，遇陰雨或久坐痛而垂者，濕也；遇諸寒而痛及喜暖而惡寒者，寒也[7]。中醫藥在腰腿痛治療中歷史悠久，腰腿痛的治療當以溫腎散寒、舒經通絡為治法。腎著湯配方較為簡便，以干姜配甘草，發揮溫中散寒功效，另以茯苓、白術健脾除濕。周佳明等[8]研究也證實，腎著湯具有祛寒除濕功能，不僅有助于減輕局部腰腿痛癥狀，還可改善腰背部肌群協調性，緩解腰肌勞損，在腰腿痛治療中具有重要價值。但目前臨床對腎著湯的療效機制尚不明確。本研究利用冷水浴方法建立寒濕性腰腿痛模型，并通過對比干預觀察腎著湯的治療效果，結果顯示，干預后A組小鼠扭體次數顯著少于B組，說明腎著湯能顯著減輕局部疼痛，這與既往報道一致[9]。

NGF是機體重要的疼痛調控因子，在正常組織中低表達或不表達，在腰椎間盤突出癥發生后，機械性壓迫作用和炎性反應引起NGF表達增加[10]。VEGF是具有多種生物學功能的細胞因子，能增加血管通透性，促進血管再生，在椎間盤突出癥病理進程中對緩解和修復椎間盤病變具有重要作用[11]。另外，PCNA與軟骨細胞增殖水平具有顯著相關性，是評估細胞增殖和修復能力的重要指標。隨著腰腿痛康復進程加快，PCNA水平也隨之升高[12]。臨床也有研究顯示，PCNA與VEGF存在正相關[13]，支持本研究結果。臨床還有基礎實驗研究也證實，正常組、造模組及干預組小鼠PCNA水平差異較大[14]。本研究顯示，A組小鼠豎脊肌組織中NGF相對表達量和陽性率均低于B組，而VEGF和PCNA顯著高于B組，提示腎著湯可能通過調控VEGF、PCNA及NGF，延緩腰椎間盤突出等病理進程，發揮治療作用。這一結果說明腎著湯可能通過調控機體神經血管因子，改善局部癥狀，達到治療目的。另外，中醫認為，寒凝血瘀也是引起腰腿痛的重要機制[15-16]。本研究還顯示，A組小鼠血漿黏度、血小板聚集率及紅細胞變形指數顯著低于B組，提示腎著湯有助于改善寒濕性腰腿痛小鼠局部血流，這與腎著湯祛寒濕、健脾胃作用密切相關[17-18]，這也說明腎著湯可能通過改善局部微血流，糾正局部血液高凝狀態，從而提高腰腿痛治療效果，這對于臨床早期干預具有重要實用價值[19]。

綜上，腎著湯治療寒濕性腰腿痛效果顯著，有助于改善局部微血流，與其調節NGF、VEGF及PCNA等細胞因子水平有關。