親水交互作用/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中高氯酸鹽

何國(guó)成 葉少媚 何思聰 張益文 賈曉菲

摘要 [目的]建立親水交互作用/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定茶葉中高氯酸鹽的方法。[方法]采用水溶液萃取茶葉中高氯酸鹽，經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，用Obelisc R色譜柱分離，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。[結(jié)果] Obelisc R色譜柱能良好地增加保留時(shí)間至4.9 min，高氯酸根在1～200 ng/mL線性良好（R2>0.999 6），回收率為79.3%～115.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤9.4%，定量限為35 μg/kg。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)單、分離效果好、靈敏度能滿足歐盟擬定限量的要求，適用于茶葉中高氯酸鹽殘留測(cè)定，為我國(guó)進(jìn)一步規(guī)范茶葉安全標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 親水交互作用;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;高氯酸鹽;保留時(shí)間;茶葉

中圖分類號(hào) TS 272.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）12-0171-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.044

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Detection of Perchlorate in Tea by High Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry and Hydrophilic Interaction Method

HE Guo-cheng，YE Shao-mei，HE Si-cong et al

（Zhongshan Quality Safety & Inspection Institute of Agricultural Products， Zhongshan，Guangdong 528437）

Abstract [Objective]To establish a high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method for the determination of perchlorate in tea. [Method]Perchlorate in tea was extracted by aqueous solution and purified by Oasis PRiME HLB solid phase extraction column， separated by Obelisc R chromatographic column， determined by high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry， and quantified by isotope internal standard method. [Result]The retention time of Obelisc R column could be well increased to 4.9 minutes. The linearity of perchlorate was good at 1-200 ng/mL （R2>0.999 6）， the recovery rate was 79.3%-115.3%， the relative standard deviation （RSD） was not greater than 9.4%， and the quantitative limit was 35 μg/kg. [Conclusion]The method has the advantages of simple operation and good separation effect， of which the sensitivity meet the requirements of the limit formulated by the European Union. It is suitable for the determination of perchlorate residue in tea and can provide a reference and theoretical basis for further standardizing tea safety standards.

Key words Hydrophilic interaction;High performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method;Perchlorate;Retention time;Tea

2016年，我國(guó)出口歐盟的茶葉被曝檢出高含量“高氯酸鹽”[1]，該事件引起了社會(huì)對(duì)茶葉質(zhì)量安全問(wèn)題的關(guān)注，特別是高氯酸鹽的污染。高氯酸鹽是一種新型環(huán)境污染物[2]，在食品、土壤和植物[3-7]中均被檢出。高氯酸鹽經(jīng)食物在人體富集發(fā)揮毒性作用，它可以干擾甲狀腺功能、新陳代謝，阻礙人體生長(zhǎng)發(fā)育，損害兒童腦部發(fā)育[8]。

目前，我國(guó)尚未對(duì)茶葉中高氯酸鹽含量作出規(guī)定，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)只有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《出口食品中高氯酸鹽的檢測(cè) 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 4089—2015），但該檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍并未涉及茶葉。現(xiàn)有檢測(cè)文獻(xiàn)大多采用水性溶劑進(jìn)行提取，經(jīng)C18固相萃取柱凈化，由離子色譜法（IC）、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（IC-MS/MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）進(jìn)行測(cè)定[9-11]。在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析中，高氯酸鹽在大多數(shù)色譜柱中保留能力欠缺（<2 min），而使用離子交換色譜柱可獲得較好的保留時(shí)間（>4 min）。D38D0108-D218-4E9E-B95A-B064107A707C

該研究使用的Obelisc R色譜柱是結(jié)合離子交換的HILIC色譜柱，用于親水交互作用色譜的固定相為極性，易吸附樣品溶液中的極性分子，從而促進(jìn)目標(biāo)物從流動(dòng)相中分配至固定相表面上的極性液層。該研究以純水萃取茶葉中高氯酸鹽，經(jīng)PRiME HLB固相萃取柱凈化，使用Obelisc R色譜柱增加保留時(shí)間（4.9 min），以LC-MS/MS測(cè)定，18O高氯酸鈉同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，美國(guó)，o2si公司）;18O高氯酸鈉同位素內(nèi)標(biāo)（100 μg/mL，美國(guó)，CIL公司）;乙腈（質(zhì)譜純，美國(guó)，F(xiàn)isher公司）;正己烷（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）;甲酸銨（色譜純，美國(guó)，F(xiàn)luka公司）;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6495A高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)，安捷倫公司）; Waters Oasis PRiME HLB凈化柱（3 mL/60 mg，美國(guó)，Waters公司）;Sielc Obelisc R色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm，美國(guó)，Sielc公司）;A11Basic研磨機(jī)（德國(guó)，IKA公司）;Millipore Mili-Q純水機(jī)（美國(guó)，密理博公司）;vortex 2漩渦振蕩器（德國(guó)，IKA公司）;THZ-82A水浴恒溫振蕩器（金壇市宏華儀器廠）;3-18KS高速離心機(jī)（德國(guó)，SIGMA公司）;KS-501振蕩器（德國(guó)，IKA公司）;KQ-500TDE超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

用高純水逐級(jí)稀釋高氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），最終配制成高氯酸根濃度分別為0、1、5、20、100 、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。18O高氯酸鈉同位素內(nèi)標(biāo)最終質(zhì)量濃度為20 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理方法。

稱取0.50 g試樣于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)（4 μg/mL）100 μL、20 mL高純水，漩渦混勻。在恒溫水浴振蕩器45 ℃振蕩2 h，超聲30 min。吸取5 mL到另一離心管中，加3 mL正己烷，搖床振蕩15 min，高速離心，取2 mL水相提取液到PRiME HLB 凈化柱中（下接濾膜），加壓使流速2 s/滴，棄初始液0.3 mL，收集于2 mL棕色樣品瓶?jī)?nèi)，待測(cè)定。同時(shí)做試劑空白。

1.3.3 儀器條件。

1.3.3.1 色譜條件。色譜柱為Sielc Obelisc R（2.1 mm×100 mm，5 μm）。流動(dòng)相A為10 mmol/L甲酸銨（含0.10%甲酸），B為90%乙腈（含0.10%甲酸）;等度洗脫，A+B=15%+85%;流速0.3 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量1 μL;運(yùn)行時(shí)間8 min/針。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集模式。干燥氣溫度200 ℃;干燥氣流速14 L/min;鞘氣溫度250 ℃;鞘氣流速11 L/min;霧化器壓力275.79 kPa;監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z為101-85（定性離子）、99-83（定量離子），內(nèi)標(biāo)為107-89，對(duì)應(yīng)的碰撞能（CE）均為18 eV;駐留時(shí)間150 ms，EMV增益200。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

ClO4-是一種極性極強(qiáng)的無(wú)機(jī)化合物，在色譜分離時(shí)，在普通C18色譜柱上幾乎不保留，且存在基質(zhì)效應(yīng)。宋正規(guī)等[12-13]使用一般HILIC色譜柱進(jìn)行分離，保留時(shí)間約1. 5 min;華永有等[14]使用T3色譜柱進(jìn)行分離，保留時(shí)間約1.6 min;李雨哲等[15-16]使用陰離子交換色譜柱進(jìn)行分離，保留時(shí)間約7 min。目前研究質(zhì)譜法測(cè)定高氯酸鹽，大多以陰離子交換色譜柱增強(qiáng)保留能力，其他類型色譜柱保留能力略有不足。該研究所用色譜柱保留時(shí)間可達(dá)4.9 min（圖1），結(jié)果表明，Obelisc R柱對(duì)高氯酸根有較強(qiáng)的保留能力。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇。

對(duì)于大多數(shù)親水色譜（HILIC）模式有機(jī)相通常選用乙腈，而不是甲醇。乙腈在HILIC模式下屬于弱洗脫的流動(dòng)相，且產(chǎn)生的柱壓比甲醇低。甲醇屬于質(zhì)子溶劑，由于其極性性質(zhì)，會(huì)與待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)固定相上的極性結(jié)合位點(diǎn)，并抑制水層的形成，導(dǎo)致保留變?nèi)酢Ｋ诖四Ｊ絼t作為強(qiáng)洗脫溶劑，在水相比例3%～40%時(shí)，增加水相比例可以增加洗脫能力。因此該研究選擇乙腈和水作為基礎(chǔ)流動(dòng)相，且在提取液中不添加甲醇。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇。HILIC模式下提高甲酸銨濃度可減弱離子交換作用，屏蔽硅醇基電荷，減弱硅醇基對(duì)帶電化合物的保留能力，優(yōu)化峰型。比較4種A相中不同濃度甲酸銨溶液，B相為90%乙腈，探討甲酸銨濃度對(duì)保留時(shí)間的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，隨著甲酸銨濃度減少，ClO4-保留能力逐漸增加，直至在8 min內(nèi)不出峰。考慮到質(zhì)譜分析中甲酸銨的濃度超過(guò)20 mmol/L時(shí)容易造成離子源鹽析，故該研究最終選用A相甲酸銨濃度為10 mmol/L。

以A相10 mmol/L甲酸銨溶液、B相90%乙腈為基礎(chǔ)，比較5種不同甲酸含量對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，甲酸含量≤0.20%時(shí)，隨著甲酸含量增大，ClO4-保留能力逐漸增強(qiáng);甲酸含量對(duì)ClO4-峰面積無(wú)明顯作用。在僅考慮保留能力情況下，選用0.10%甲酸含量較為合適。

2.2.3 色譜柱溫度的優(yōu)化。

在A相10 mmol/L甲酸銨（含0.10%甲酸）、B相90%乙腈（含0.10%甲酸）的基礎(chǔ)上，比較4種柱溫25、30、35、40 ℃，得到ClO4-保留時(shí)間分別為4.9、4.7、4.6、4.5 min，可見(jiàn)柱溫對(duì)ClO4-峰面積無(wú)明顯作用。隨著柱溫上升，ClO4-保留能力逐漸減弱，且作用明顯。考慮該研究目的是增加ClO4-的保留能力，故選用柱溫25 ℃。D38D0108-D218-4E9E-B95A-B064107A707C

2.3 線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍1～200 ng/mL，以定量離子和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為Y軸，以高氯酸根和內(nèi)標(biāo)濃度的比值作為X軸，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行線性擬合，得出線性回歸方程為Y=1.820 575X+0.183 374（R2>0.999 6），線性關(guān)系良好。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

選取高氯酸鹽本底低的3種茶葉，以40、80、400 μg/kg添加水平重復(fù)測(cè)定6次，扣除本底后測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可知，此次試驗(yàn)回收率在79.3%～115.3%，RSD≤9.4%，說(shuō)明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5 定量限

按10倍信噪比（S/N）為定量限計(jì)算，白茶、紅茶、綠茶的定量限分別為23、35、18 μg/kg，故該方法的定量限為35 μg/kg，滿足歐盟擬定茶葉中高氯酸鹽參考?xì)埩袅浚?.75 mg/kg）。

2.6 樣品測(cè)定 應(yīng)用該方法對(duì)110份茶葉樣品進(jìn)行測(cè)定，其中高氯酸鹽含量>0.75 mg/kg有 8份，占比7.3%，說(shuō)明茶葉中高氯酸鹽污染存在一定風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起相關(guān)部門(mén)重視。

3 結(jié)論

該研究采用Obelisc R分離技術(shù)，有效地解決了高氯酸鹽在反相色譜上保留性能不佳、基質(zhì)效應(yīng)干擾嚴(yán)重的檢測(cè)難點(diǎn)。該方法操作簡(jiǎn)單、分離效果好、靈敏度能滿足歐盟擬定限量的要求，適用于茶葉中高氯酸鹽殘留測(cè)定，為我國(guó)進(jìn)一步規(guī)范茶葉安全標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

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