丹參酮IIA 改善長時間異氟烷麻醉介導星形膠質細胞鐵死亡

李冰清 王靖澔 張鵬 蔡敏 趙廣超

摘要：全身麻醉藥物的神經毒性是重要的臨床問題。既往研究表明，多種麻醉藥物均可引起神經細胞發生鐵死亡，從而介導圍術期神經認知損傷癥狀。然而全麻對腦內非神經元類型細胞的鐵死亡過程是否存在影響尚未得到闡明，且缺乏有效的干預措施。本研究證實長時間異氟烷麻醉可介導星形膠質細胞鐵死亡，應用鼠尾草根提取物丹參酮IIA可有效逆轉這一死亡過程，研究為全麻所致圍術期腦功能并發癥的防治提供證據。

關鍵詞：異氟烷;鐵死亡;丹參酮;神經保護

【中圖分類號】? R782.05+4【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）17--01

前言

近年來全身麻醉的安全性已得到顯著提高，由麻醉所導致的直接死亡已不足1/25萬，然而高危手術患者，如老年人群與發育期兒童，在接受全麻手術后有可能出現認知功能減退、注意力缺陷等腦功能異常癥狀，并持續至術后遠期[1]。因此，探究全麻藥物對大腦神經細胞存活的影響仍具有重要意義。

1.方法

1. 比色法測量CCK-8含量檢測細胞活性

使用TRIzol裂解細胞，將對照組、異氟烷組及丹參酮IIA處理組細胞以密度1.0×104個/孔接種至96孔板，加入CCK-8檢測試劑，并在37 ℃ 、5%CO2培養箱中孵育培養2～4 h，空白組僅加入CCK-8檢測試劑，不加入細胞，作為吸光度參考值。采用酶標儀在450 nm處測定各孔細胞吸光度值（A），并計算細胞的存活率，細胞存活率=（A實驗組-A空白）/（A對照組-A空白），每組6個復孔，重復4次。

2. Western blot檢測細胞中GPX4、4HNE蛋白水平

裂解培養的星形膠質細胞，并進行細胞內總蛋白的提取。用BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度，每上樣孔20μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶進行封閉，加入對應一抗，4℃孵育過夜;加入對應二抗孵育1小時，用1×TBST洗膜3次，每次5min。采用ECL化學發光法檢測，并計算蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶和內參蛋白條帶的灰度值比值反應目的蛋白的含量變化。

3. 丹參酮IIA及Fer-1藥物使用

丹參酮IIA（Tanshinone IIA，TSA）在使用前于5%的DMSO溶液中進行溶解。在異氟烷麻醉開始前，向星形膠質細胞培養液中加入50 nM濃度的TSA，并在37 ℃ 、5%CO2培養箱中孵育培養2～4 h。孵育完成后進行異氟烷麻醉處理。在處理后，我們使用鐵蛋白抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1）來驗證鐵死亡途徑（濃度為10μM）。

4. 統計分析

所有實驗在單盲體系下完成。結果以平均值±標準差形式展示。采用參數t檢驗及單因素方差分析（One-way ANOVA）參數檢驗評價各生理指標，對比應用Prism 8.0軟件統計。p < 0.05被認為差別具有顯著性。

2.結果

2. 應用丹參酮IIA（TSA）逆轉異氟烷麻醉介導的星形膠質細胞鐵死亡

為驗證丹參酮IIA對抗異氟烷麻醉所致星形膠質細胞鐵死亡的效能，我們開展藥理學干預實驗。結果表明，異氟烷麻醉前使用TSA提前孵育，可有效逆轉麻醉所致的星形膠質細胞LDH釋放增多（ISO+Vehicle vs. ISO +TSA，0.45±0.02 vs. 0.41±0.01，p<0.05，n=4，One-way ANOVA）（圖1.a），同時顯著上調培養體系中CCK-8含量（ISO+Vehicle vs. ISO +TSA，2.53±0.07 vs. 2.73±0.09，p<0.05，n=4，One-way ANOVA），提高星形膠質細胞活性。在此基礎上，我們使用細胞ROS定量檢測，以及Western Blot方法測量4-羥基壬醛（4-HNE）的表達含量，以評估應用TSA對星形膠質細胞鐵死亡所致脂質過氧化進程。結果表明，TSA處理組細胞ROS豐度顯著降低（ISO+Vehicle vs. ISO +TSA，2.06±0.71 vs. 1.25±0.17，p<0.05，n=6，One-way ANOVA）（圖1.c），同時異氟烷麻醉前使用TSA孵育后，麻醉后的4-HNE表達較對照組顯著降低（ISO+Vehicle vs. ISO +TSA，4.99±0.57 vs. 2.57±0.17，p<0.001，n=4，One-way ANOVA）（圖1.d）。上述證據表明，預防性使用丹參酮IIA，可有效改善長時間異氟烷麻醉介導的星形膠質細胞鐵死亡，達到神經保護的目的。

3.討論

既往研究證實，異氟烷、七氟醚、氯胺酮等多種麻醉藥物，均可通過誘導神經細胞鐵死亡導致圍術期腦功能損傷[ 2]，然而針對這一死亡途徑的有效預防措施仍有待開發。丹參酮IIA是從鼠尾草根部分離出來的一種脂溶性的活性成分[3]，盡管在既往研究中已被證實可通過調節細胞內氧化還原狀態來保護細胞，從而達到心腦等重要器官保護的目的，但其對內皮細胞與腫瘤細胞的鐵死亡途徑的調節過程具有較大的異質性，在消化道腫瘤細胞中可促進鐵死亡以抑制腫瘤增殖，但可抑制血管內皮細胞鐵死亡以改善循環功能。

參考文獻：

[1]第294期雙清論壇”麻醉學前沿與交叉”， 中華麻醉學雜志 [J]. 2021， 41（11）： 1.

[2]ZHAO L， GONG H， HUANG H， et al. Participation of Mind Bomb-2 in Sevoflurane Anesthesia Induces Cognitive Impairment in Aged Mice via Modulating Ferroptosis [J]. ACS Chem Neurosci， 2021， 12（13）： 2399-408.

[3]ANSARI M A， KHAN F B， SAFDARI H A， et al. Prospective therapeutic potential of Tanshinone IIA： An updated overview [J]. Pharmacol Res， 2021， 164（105364.

基金項目：國家自然科學基金項目（81901080）

作者簡介：李冰清（2001-），女，八年制臨床專業，主要研究方向：麻醉學

△通訊作者：趙廣超（1992-），男，主治醫師，講師，主要研究方向：麻醉學， E-mail： gczhao0518@outllook.com