北五味子多糖對缺氧/復氧心肌細胞氧化應激損傷的保護作用

劉 蕾，趙雪東，王智彬

急性心肌梗死是臨床常見的缺血性心血管疾病類型，近年來，缺血性心血管疾病發生率及死亡率逐年增加，嚴重威脅人類生命。臨床采用冠狀動脈介入等方式治療急性心肌梗死，但心肌再灌注導致心肌缺血再灌注損傷發生[1-2]。目前關于心肌缺血再灌注損傷的分子機制尚未明確。有研究顯示，九龍藤總黃酮等中醫藥具有抗氧化、抗炎等作用[3]，但關于中醫藥對心肌細胞氧化損傷的作用機制尚未明確。五味子是我國傳統中藥，具有補腎寧心、益氣生津的功效，其中北五味子多糖(schisandra chinensis polysaccharide，SCP)具有抗氧化、增強免疫力、抗腫瘤等作用，有研究表明，SCP可抑制促炎因子釋放，抑制炎癥反應[4]。但SCP對缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌細胞氧化損傷的作用機制尚未明確。巨噬細胞中微小RNA(microRNA，miR)-212-3p表達下調，miR-212-3p通過靶向調控高遷移率族蛋白B1(HMGB1)抑制脂多糖誘導的炎癥反應[5]。生物信息學分析顯示，10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)可能是miR-212-3p的靶基因，抑制PTEN表達可抑制H/R誘導的星形膠質細胞凋亡[6]。本研究通過分析SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的影響，分析對miR-212-3p/PTEN分子軸的調控作用，為SCP治療急性心肌梗死等心血管疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 SCP購自秦皇島旭光生物科技有限公司，采用二氧化碳瘤體萃取SCP，分離水溶性成分與脂溶性成分，應用超聲波攪拌，超聲波預處理40 min后浸潤，采用酶法與三氯乙酸結合脫蛋白得到SCP，提取有效率為77.6%，純度為50%[7]。大鼠心肌細胞H9c2由深圳市百恩維生物科技有限公司提供；miR-212-3p mimics、anti-miR-212-3p、miR-NC、anti-miR-NC由廣州銳博生物科技有限公司提供；兔抗鼠PTEN抗體由北京百奧萊博科技有限公司提供；兔抗鼠Bax、Cleaved Caspase-3抗體均由美國Santa Cruz公司提供；山羊抗兔二抗由美國Abcam公司提供；凋亡試劑盒由美國Sigma公司提供；Trizol試劑、反轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒均由北京天根生化科技有限公司提供；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。Lipofectamine 2000由美國Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 心肌細胞用含10%胎牛血清的培養基在常規培養箱(37 ℃、5%CO2、95%空氣)中培養，胰酶消化80%融合細胞，之后以每孔150 μL接種96孔板，加入預先用95%N2與5%CO2飽和過的不含血清的培養基，細胞置于厭氧培養箱(95%N2和5%CO2)中缺氧處理2 h，棄孔內培養基，更換為含血清培養基，將細胞置于常規培養箱內復氧處理4 h[8]，作為H/R組。正常培養細胞作為Con組。分別使用25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的SCP對心肌細胞進行24 h的處理[9]，同時進行H/R處理，依次作為H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組。分別將anti-miR-NC、anti-miR-212-3p轉染至心肌細胞后加入100 μg/mL SCP處理心肌細胞24 h，并進行H/R處理，分別作為H/R+SCP-H+anti-miR-NC組、H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p組。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將轉染后的心肌細胞常規接種，并按上述分組方法進行處理，常規培養并收集細胞1.0×106個，使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行2次清洗，與500 μL細胞懸液混勻，并依次加入5 μL染色液(Annexin V-FITC)及碘化丙啶(PI)，混勻后避光孵育15 min，應用流式細胞儀嚴格按照凋亡試劑盒操作說明對細胞凋亡情況進行分析。

1.2.3 氧化應激指標LDH、SOD、MDA含量檢測 收集各組心肌細胞培養上清液，按照LDH試劑盒說明加入相應試劑，應用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，計算LDH含量。取對數生長期心肌細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于培養皿(100 mm×20 mm)，室溫孵育24 h，按照1.2.1分組處理后，棄上清液，加入0.25%胰蛋白酶消化，離心后收集細胞，根據試劑盒步驟檢測細胞SOD活性、MDA含量。

1.2.4 RT-qPCR檢測細胞miR-212-3p、PTEN mRNA表達水平 按上述分組方法進行處理，Trizol法常規提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄合成cDNA，并配置RT-qPCR反應體系，按照熒光定量試劑盒使用說明完成PCR，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算miR-212-3p、PTEN mRNA相對表達量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-212-3p的靶基因 starBase證實PTEN與miR-212-3p有結合位點。常規構建野生型及突變型PTEN的熒光素酶載體WT-PTEN及MUT-PTEN，并將其分別與miR-NC、miR-212-3p mimics共轉染至心肌細胞，轉染24 h后，嚴格依據說明完成細胞相對熒光素酶活性的檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達 心肌細胞常規加入RIPA裂解液完成細胞總蛋白的提取。蛋白變性后進行十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，常規進行轉膜、封閉2h，依次常規加入一抗稀釋液(1∶1 000)，孵育、洗膜，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，孵育、洗膜。加入電化學發光液(ECL)，暗室顯影、拍照，以GAPDH為內參，應用Image J軟件分別對各蛋白條帶灰度值進行分析。

2 結 果

2.1 SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響 H/R組細胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平高于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組細胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響(A為各組細胞凋亡流式細胞圖；B為各組Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達條帶圖)

表1 SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響(±s)

2.2 SCP對H/R誘導的心肌細胞氧化應激指標的影響 H/R組心肌細胞LDH、MDA含量高于Con組(P<0.05)，SOD含量低于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組心肌細胞LDH、MDA含量降低(P<0.05)，SOD含量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表2。

表2 SCP對H/R誘導的心肌細胞氧化應激指標的影響(±s)

2.3 SCP對H/R誘導的心肌細胞miR-212-3p、PTEN mRNA表達量的影響 H/R組心肌細胞miR-212-3p相對表達量低于Con組(P<0.05)，PTEN mRNA相對表達量高于Con組(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+SCP-L組、H/R+SCP-M組、H/R+SCP-H組心肌細胞miR-212-3p相對表達量升高(P<0.05)，PTEN mRNA相對表達量降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 SCP對H/R誘導的心肌細胞中miR-212-3p、PTEN mRNA表達量的影響(±s)

2.4 miR-212-3p靶向調控PTEN的影響 starBase預測顯示PTEN的3′UTR中含有與miR-212-3p互補的核苷酸序列，詳見圖2。miR-212-3p過表達導致WT-PTEN熒光素酶活性降低(P<0.05)，對MUT-PTEN熒光素酶活性影響差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表4。miR-212-3p組細胞PTEN蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-212-3p組細胞PTEN蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。詳見圖3、表5。

圖2 PTEN的3′UTR中含有與miR-212-3p互補的核苷酸序列

表4 miR-212-3p過表達對熒光素酶活性的影響(±s)

圖3 PTEN蛋白表達條帶圖

表5 miR-212-3p靶向調控PTEN蛋白表達的影響(±s)

2.5 干擾miR-212-3p表達減弱SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的影響 與H/R+SCP-H+anti-miR-NC組比較，H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p組細胞凋亡率及LDH、MDA含量升高(P<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)，miR-212-3p、SOD含量降低(P<0.05)。詳見圖4、表6。

圖4 干擾miR-212-3p表達能減弱SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的影響(A為細胞凋亡流式細胞圖；B為PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達條帶圖)

表6 干擾miR-212-3p表達能減弱SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的影響(±s)

3 討 論

心肌再灌注是治療急性心肌梗死的主要手段，臨床主要采用經皮冠狀動脈成形術等血管再通術進行治療，但心肌再灌注可能造成心肌細胞損傷。相關研究顯示，傳統中藥具有抗氧化、抑制血栓形成等作用[10-12]，但其在急性心肌梗死治療中的作用機制尚未明確。本研究探討SCP對H/R誘導心肌細胞損傷的影響和保護機制，為急性心肌梗死等心血管疾病的治療提供新方向。

SCP通過改善高脂血癥大鼠脂質代謝從而減輕肝損傷[13]。SCP具有降血脂、保護血管內皮功能的作用，可減輕氧化應激損傷[14]。SCP可抑制異丙腎上腺素誘導的心室重構[15]。本研究結果顯示，H/R可誘導心肌細胞凋亡，而SCP使H/R誘導的心肌細胞凋亡率降低，提示SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡具有抑制作用。心肌細胞缺氧后導致細胞內三磷酸腺苷(ATP)減少，從而促使LDH等心肌酶從胞漿內漏出，LDH活性可反映心肌損傷程度，SOD可清除體內自由基及活性氧，屬于抗氧化酶類；MDA屬于過氧化脂質代謝產物，其水平升高可加重氧化應激反應發生[16]。本研究結果顯示，H/R可提高心肌細胞MDA含量，提高培養液LDH活性，降低SOD活性，而SCP呈劑量依賴效應降低H/R誘導心肌細胞MDA含量，提高SOD活性，并抑制培養液LDH活性，提示SCP可抑制H/R誘導的心肌細胞氧化損傷。

miR-212-3p通過下調SOX5的表達，抑制成纖維樣滑膜細胞增殖，并促進細胞凋亡，從而減輕炎癥反應[17]。miR-212-3p通過靶向MeCP2調節早期神經發生[18]。抑制PTEN表達可抑制敗血癥誘導的心肌細胞凋亡[19]。本研究結果顯示，miR-212-3p可靶向結合PTEN，H/R后，心肌細胞miR-212-3p表達降低，PTEN表達升高。使用不同劑量的SCP處理后，心肌細胞miR-212-3p表達升高，PTEN表達降低，提示SCP可能通過上調miR-212-3p表達，下調PTEN表達，進而發揮抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的作用。為驗證上述推測，本研究轉染anti-miR-212-3p至心肌細胞，使用SCP處理后進行H/R處理，結果顯示，干擾miR-212-3p表達能減弱SCP對H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷的保護作用。提示SCP可能通過對miR-212-3p/PTEN分子軸的調控作用，減弱H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激反應。

綜上所述，SCP可抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激損傷，作用機制可能與SCP對miR-212-3p/PTEN分子軸的調控作用有關，為SCP抗心肌細胞凋亡及氧化應激提供實驗依據，同時為急性心肌梗死等心血管疾病的治療提供新思路。