結腸癌組織中差異表達circRNA的篩選與驗證*

孫 林,沈永奇,孫一帆,龍海華,陳建林,易青群,龔敏珍,莫遠群

廣西醫科大學附屬柳鐵中心醫院：1.檢驗科；2.腫瘤科；3.消化內科；4.胃腸外科，廣西柳州 545007

結腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率在全國惡性腫瘤中均居前5位[1],早期診斷尤為重要。目前對結腸癌的早期篩查主要依靠糖類抗原檢測，其特異性較高，但靈敏度較差，導致早期診斷率較低，急需尋找一種更為有效的篩查方法。隨著RNA測序技術的高速發展，環狀RNA(circRNA)已被認為是細胞分化以及疾病發展的重要調控因子[2]。研究發現，circRNA在腫瘤發生、發展中發揮重要的調控作用，可能會成為結腸癌早期篩查的一種新型生物標志物[3]。本研究通過對臨床結腸癌組織及配對癌旁組織的樣本circRNA表達進行比較，篩選具有表達差異的circRNA，并分析其在結腸癌發生、發展中的作用。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月至2019年12月在柳州市柳鐵中心醫院進行手術治療的術前未進行過放療或化療的50例結腸癌患者納入研究。收集上述患者手術治療中取得的病變組織(經病理學檢查確診為結腸癌組織)及相應癌旁組織(距離癌變部位邊界>2.0 cm)凍存標本。患者及家屬對本研究均知情同意并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2試劑與儀器 Trizol試劑購自Invitrogen公司；總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；Arraystar Super RNA Labeling Kit、Arraystar Human circRNA Arrays V2芯片(8×15K)為Arraystar公司產品；逆轉錄試劑盒購自Qiagen公司；實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自Takara公司；Agilent Hybridization Oven、Agilent Scanner G2505C為Agilent公司產品；核酸蛋白定量儀Nanodrop ND-1000為Nanodrop公司產品；AB7500 qPCR儀為Applied Biosystems公司產品。qPCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR的引物設計

1.3方法

1.3.1結腸癌組織及癌旁組織總RNA的提取 使用Trizol試劑在液氮冷凍狀態下研磨組織，用總RNA提取試劑盒獲得總RNA，然后用Nanodrop ND-1000 檢測RNA的質量和濃度。

1.3.2篩選結腸癌circRNA差異表達數據 從納入研究的結腸癌病例中隨機選取3例腫瘤組織及配對癌旁組織標本提取總RNA，使用8×15K的Human circRNA Arrays V2芯片進行circRNA雜交檢測，用Agilent Scanner G2505C儀器對雜交、洗片后的基因芯片進行掃描，獲取cricRNA芯片原始圖像資料檢測數據。應用圖像分析軟件對獲得的圖像資料進行數據提取，進一步采用R軟件包limma依據算法Quantile對circRNA原始芯片信號數據進行標準化和均一化處理，以P<0.05且差異表達倍數(FC)>1.5的條件篩選結腸癌差異表達的circRNA，然后在篩選的circRNA中選擇上調或下調差異表達倍數排在前8位的8個circRNA做進一步的驗證。

1.3.3qPCR檢測驗證circRNA的表達 按照逆轉錄試劑使用說明書上的操作將結直腸癌組織及其癌旁組織提取的總RNA逆轉錄為cDNA；再按照qPCR試劑盒的操作說明書進行qPCR檢測，每孔均設3個復孔，取平均Ct值作為該樣本最后Ct值，計算2-ΔΔCt來反映circRNA的相對表達水平。

1.3.4差異表達circRNAs的生物信息學分析 通過生物信息相關數據庫對差異表達的circRNA進行GO數據庫(http://amigo.geneontology.org/amigo)基因功能富集分析(GO分析)和KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/)信號通路分析(KEGG分析)，預測差異表達的circRNA相關的生物學功能。

2 結 果

2.1基因芯片原始數據均一化 經過重新標準化和均一化后消除了染色偏差和點樣針頭帶來的空間差異引起的基因表達量的不同，癌組織和癌旁組織樣本的circRNA表達譜標準化后的熒光信號強度均基本一致，從而使得到的基因表達量的差異以及變化具有生物學意義，可用于進一步表達譜分析，見圖1。

注：C1～C3為癌組織標本；P4～P6為癌旁組織標本；C1與P4配對，C2與P5配對，C3與P6配對。

2.2表達譜芯片數據進行差異基因篩選分析 基因芯片在結腸癌組織和癌旁組織中共檢出5 990個circRNAs，以FC>1.5且P<0.05為篩選標準，篩選出114個差異表達circRNA，其中62個circRNA上調表達，52個circRNA下調表達；前8位明顯上調和明顯下調的circRNAs，見表2。繪制差異表達circRNAs火山圖，見圖2，圖中兩側深色點即代表癌組織及癌旁組織存在差異表達的circRNAs，左側的深色點代表在結腸癌組織下調表達的circRNAs，右側的深色點代表在結腸癌組織上調表達的circRNAs；從圖2中發現在結直腸癌中下調表達的cricRNAs比上調表達的circRNAs離散程度較大，結合表2中下調表達的circRNAs FC較大。因此，在結腸癌中低表達的circRNAs FC可能更大。

注：FDR表示偽發現率。

表2 在結腸癌組織中表達上調和下調的circRNA(前8個)

2.3在結腸癌組織中驗證低表達circRNAs 在結腸癌組織和癌旁組織中對所篩選的circRNAs表達量進行聚類分析，研究發現在結腸癌中以低表達circRNAs為主，筆者挑選了其中FC較大的8個表達下調的circRNAs,見表2。將它們的數據進行聚類分析，聚類熱圖見圖3A：右邊代表該基因在組織中高表達，左邊代表該基因在組織中低表達，顏色越深代表差異表達的程度越大。結果顯示，hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049在結腸癌組織中比癌旁組織中表達明顯下調，這與之前分析得到的結果相一致。接著筆者從納入研究的病例中，隨機選取了9例結腸癌組織及配對癌旁組織標本進行qPCR檢測驗證，見圖3B，顯示hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、 hsa_circRNA_000367、 hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049 8個circRNA在結腸癌組織中的表達水平相比在癌旁組織的中表達水平顯著下降，這與之前生物信息學預測分析的結果一致。

注：A為篩選的8個circRNA的熱圖分析結果；B是用qPCR方法驗證8個circRNA在腫瘤組織中的表達；兩組間比較，*表示P<0.05，**表示P<0.001；C1～C3為癌組織標本；P4～P6為癌旁組織標本；C1與P4配對，C2與P5配對，C3與P6配對。

2.4差異表達circRNA的GO分析和KEGG分析 GO分析顯示：結腸癌組織下調表達的8個circRNA的宿主基因可能參與的生物學過程(BP)主要富集在轉錄調控、神經營養蛋白TRK受體信號通路、表皮生長因子受體信號通路、轉化生長因子受體信號通路、基因表達的負調控等；可能涉及的細胞成分(CC)主要富集在核質、細胞質、細胞膜、核仁等；可能參與的分子功能(MF)主要富集在RNA結合、蛋白質結合、轉錄因子激活、poly(A)RNA結合、泛素蛋白連接酶結合等。KEGG分析發現，結腸癌組織下調表達的這8個circRNA的宿主基因與病毒致癌作用、FOXO信號通路、p53信號通路、調節干細胞多能性的信號通路、蛋白多糖在腫瘤中的作用、細胞周期、結腸癌發生等相關。

3 討 論

circRNA是由5′和3′末端首尾環化形成一個特殊環狀結構，通過套索驅動環化和內含子配對驅動環化形成的環形RNA[4-5]。circRNA廣泛存在于不同生物的細胞質中，具有多樣性和高度的穩定性，在真核生物的生長發育中發揮重要的作用[6-7]。研究發現，circRNA還具有與RNA結合蛋白相互作用，作為轉錄調節因子、RNA媒介基因表達的表觀遺傳調控產物等生物學功能[8-10]，參與腫瘤的生長發育。

在結腸癌的研究發現，circRNA_104916可通過抑制上皮間質轉化進而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲作用[11]。circPIP5K1A可以抑制miR-1273a的表達促進細胞的侵襲和遷移，調節腫瘤的發展[12]。circRNA在結腸癌中可通過“海綿”吸附作用調節miRNA的表達進而調節腫瘤的發展，circPPP1R12A經“海綿”吸附結合miR-375調節靶基因CTNNB1的表達進而促進結腸癌的發展[13]；circRNA_100859可作為一個致癌基因經“海綿”吸附作用于miR-217，調節靶基因HIF-1α的表達，因此通過circRNA_100859-miR-217-HIF-1α軸可調控結腸癌的發展[14]。研究發現circRNA不僅可以調控結腸癌的發展還可調節對藥物的抵抗作用，circ_0020095可直接與miR-487a-3p結合靶向調節SOX9基因活性，促進結腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進腫瘤的發生、發展；增強結腸癌對順鉑藥物的抵抗[15]。circRNA在結腸癌中的生物功能多樣化，因此circRNA可作為結腸癌臨床診斷及預后評估的生物標志物。

本研究通過3例配對結腸癌及癌旁組織樣本的circRNAs表達譜進行全面測序，按FC>1.5且P<0.05為篩選標準，篩選出114個差異表達circRNA，其中62個circRNA上調表達，52個circRNA下調表達。通過火山圖、聚類熱圖等分析，在結腸癌組織中篩選出差異表達顯著下調的前8個circRNA，并通過qPCR驗證hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、hsa_circRNA_001729、hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049在腫瘤組織中表達水平降低。

對這8個差異表達的circRNAs進行GO和KEGG分析。GO分析顯示：BP主要富集在轉錄調控、神經營養蛋白TRK受體信號通路、表皮生長因子受體信號通路、轉化生長因子受體信號通路等；CC主要富集在核質、細胞質、細胞膜等；MF主要富集在RNA結合、蛋白質結合、轉錄因子激活等。KEGG分析顯示：主要與FOXO信號通路、p53信號通路、調節干細胞多能性的信號通路、蛋白多糖在腫瘤中的作用、細胞周期等相關。細胞周期是細胞分裂和復制的過程，與細胞的增殖分化密切相關，而不受控的細胞增殖是癌癥發生、發展的特征之一[16]。p53信號通路是細胞凋亡信號通路之一，與胃癌、宮頸癌、胰腺癌、結腸癌等的發生、發展相關[17-21]。

綜上所述，經篩選與分析，本研究發現hsa_circRNA_404686、hsa_circRNA_102293、hsa_circRNA_000367、hsa_circRNA_104270、 hsa_circRNA_001729、 hsa_circRNA_100790、hsa_circRNA_105039、hsa_circRNA_102049 8個在結腸癌組織中表達下調的circRNA，可能影響結腸癌發生、發展，有可能成為潛在的標志物，為今后研究結腸癌發生機制提供理論依據。同時，本研究存在一些不足，由于臨床病例數和實驗時間的限制，未進行后續驗證，相關作用機制僅為預測結果；實驗分組還需要進一步細化，納入各臨床病理分期的組織樣本；需要收集更多的臨床組織樣本。本研究對癌組織中上調表達的circRNAs沒有進行初步驗證，是因為發現其FC沒有下調表達的circRNAs大,筆者認為下調表達的circRNAs更值得去研究。