p-AKT-mTOR-p70S6K信號通路蛋白與卵巢癌化療耐藥相關性的研究

劉文涓　　葉孜淵　　曹蘭琴

[摘要] 目的 探討p-AKT-mTOR-p70S6K信號通路蛋白與卵巢癌化療耐藥相關性。 方法 選取2007年2月～2014年5月中南大學湘雅醫院收治的卵巢癌患者43例，其中18例患者為耐藥組，25例患者為敏感組，對43例患者均實施免疫組化方法檢測，對患者p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在兩組患者中的表達量情況進行觀察。 結果 p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有明顯較高的陽性表達率，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 p-AKT-mTOR-p70S6K信號通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有較高的陽性表達率，具有較高的臨床推廣價值。

[關鍵詞] 卵巢癌;化療;耐藥;p-AKT蛋白;mTOR蛋白;p70S6K蛋白

[中圖分類號] R737.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）17-0084-03

Study on the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer

LIU Wenjuan1? ?YE Ziyuan1? ?CAO Lanqin2

1.General Hospital of Pingxiang Mining Group Co.， Ltd.， Pingxiang 337000， China;2.Department of Obstetrics and Gynecology， Xiangya Hospital Central South University，Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To explore the correlation between p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway protein and chemotherapy resistance in ovarian cancer. Methods A total of 43 ovarian cancer patients who were admitted to Xiangya Hospital Central South University from February 2007 to May 2014 were selected. Among them， 18 patients were in the drug-resistant group， 25 patients were in the drug-sensitive group. Immunohistochemical methods were performed in all 43 patients. The expression levels of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in the two groups of patients were observed. Results The positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues were significantly higher than those in sensitive tissues， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion In the p-AKT-mTOR-p70S6K signaling pathway， the positive expression rates of p-AKT protein， mTOR protein， and p70S6K protein in ovarian cancer chemotherapy-resistant tissues are significantly higher， which can be used as clinical markers to predict ovarian cancer chemotherapy resistance and have high clinical promotion value.

[Key words] Ovarian cancer; Chemotherapy; Drug resistance; p-AKT protein; mTOR protein; p70S6K protein

卵巢癌在臨床中十分常見，具有較高的病死率與發病率，由于卵巢癌早期并未具有顯著的臨床癥狀表現，因而當患者被確診時多發展至臨床晚期，對其造成較大的不良影響[1]。且通過觀察發現，晚期腫瘤會發生盆腹腔廣泛轉移擴散，患者5年生存率僅為45%[2]。腫瘤細胞減滅術及鉑類聯合紫杉醇的系統化療是臨床中醫生較多使用的方式，雖然能獲得一定的效果，但仍會導致患者出現耐藥的不良情況[3]。大鼠磷酸化AKT（p-AKT）蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶（mTOR）蛋白、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）蛋白能夠對細胞凋亡與增殖起到有效的調節作用，明確其含量，則能夠采取有效的措施進行應對，從而降低耐藥性，確保患者獲得良好的化療效果，最終可有效改善患者的健康水平[4]。本研究對其進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取中南大學湘雅醫院婦產科2007年2月～2014年5月間收治的43例原發性卵巢上皮癌患者首次手術切除且保存在我院病理科的組織標本石蠟切片。將43例患分為耐藥組18例與敏感組25例。耐藥組年齡31～62歲，平均（49.21±6.82）歲;敏感組年齡31～63歲，平均（49.73±7.21）歲。兩組病例的臨床特征比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意。納入標準：①所有患者進行腫瘤細胞減滅術及全面的分期手術后幾乎無殘留病灶;②經術后病理證實所有患者的疾病類型均為上皮性卵巢癌;③行卵巢癌減滅術及予以6～8個療程的紫杉醇及鉑類基礎化療的患者，半年內未復發。排除標準：①未完成治療患者;②患有其他婦科惡性腫瘤疾病。

1.2 方法

1.2.1 組織切片的制備? 將組織切片后使用10%福爾馬林溶液對其進行24～48 h的固定;首先采用梯度乙醇脫水方式對組織進行脫水處理，使用二甲苯對切片組織進行透明處理，然后將組織切片溶融石蠟中，每次浸泡30 min，共3次，再包埋;將包埋好的石蠟塊制作成為5μm的切片;之后使用蘇木精-伊紅對切片進行染色處理。

1.2.2 免疫組化檢測? 對染色后的切片進行脫蠟與水化處理;使用PBS沖洗液進行2次沖洗，每次各沖洗5 min;用蒸餾水或PBS配置新鮮的3% H2O2，在室溫環境下進行5～10 min的封閉，使用蒸餾水進行3次沖洗;對切片實施抗原修復，之后使用PBS沖洗液進行5 min的沖洗;滴加正常山羊血清封閉液，在室溫環境下進行約20 min的封閉，之后將多余液體甩去;滴加Ⅰ抗（p-AKT：1：100、mTOR：1：80、o70s6K：1：100），在37℃的條件下孵育1 h，之后使用PBS沖洗液進行3次沖洗，每次各2 min;滴加生物素化二抗，在20～37℃的條件下孵育20 min，之后使用PBS沖洗液進行三次沖洗，每次各2 min;滴加試劑SABC，在20～37℃的條件下孵育20 min，之后使用PBS沖洗液進行4次沖洗，每次各5 min;使用DAB顯色試劑盒使其顯色;使用蒸餾水進行沖洗，之后使用蘇木素進行2 min的復染，鹽酸酒精進行分化;最后脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 拍照? 每張片子在4倍鏡下拍3張、20倍鏡下拍3張。依據Fromowitz綜合計分方式對免疫組化結果實施判定。染色強度判定結果如下：無染色、淡黃色、淺棕黃色、大量深棕黃色顆粒的計分分別為0～3分;陽性細胞數評分：0～4分分別代表<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%;兩者之和<2分計陰性（-），弱陽性（+）、中度陽性（++）、強陽性（+++）的計分范圍分別是2～3分、4～5分、6～7分。

1.3 觀察指標

①p-AKT蛋白的表達與耐藥、敏感的關系。②mTOR蛋白的表達與耐藥、敏感的關系。③p70S6K蛋白的表達與耐藥、敏感的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。相關性采用Spearman分析法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-AKT蛋白的表達與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關系

p-AKT蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中的陽性表達率顯著較高，相較于敏感組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 mTOR蛋白的表達與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關系

mTOR蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達率，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 p70S6K蛋白的表達與卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感的關系

p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達率，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

卵巢癌在臨床中十分常見，臨床醫生于1996年開始將鉑類藥物與紫杉醇作為治療卵巢癌的常用化療藥物;然而由于部分卵巢癌患者并未對化療具有較高的敏感度因而無法獲得理想的治療效果。在對患者實施手術與化療后，約超過一半的患者發生急性化療耐藥并死亡現象，因此需要采取有效的措施改善其耐藥情況，以使患者獲得良好的治療效果，并提升其生存率。目前相關的專家學者發現卵巢癌耐藥與許多化療藥物相關靶標分子與信號通路存在密切關聯[6，7]。臨床醫生多使用紫杉醇等一線化療藥物對患者實施化療治療，通過對患者的隨訪觀察可知，雖然該藥物能夠使患者獲得良好的效果，但也將產生較為嚴重的耐藥情況，從而最終無法使患者獲得良好的康復效果[8]。通過研究分析可知，在調節細胞凋亡與增殖的過程中，p-AKT/mTOR/p70S6K蛋白具有重要的參與作用，其可通過調節細胞生長使患者產生較大的化療耐藥情況，因此若能夠對其表達量進行精準測量，并采取針對性的措施進行應對處理，從而能夠有效降低甚至避免耐藥情況的發生，確保患者獲得良好的化療與康復效果[9，10]。依據本研究結果可知，p-AKT-mTOR-p70S6K信號通路中的3種蛋白在卵巢癌化療耐藥組中均具有顯著較高的表達。紫杉醇在臨床中多被用于治療卵巢癌與乳腺癌，能夠獲得較佳的療效;若AKT表達發生較大的不良情況，則會在較大程度上發生耐藥情況。依據國內相關學者的研究也發現，耐藥性會隨著p-AKT蛋白的陽性表達的提升而提升。本研究中，AKT蛋白在卵巢癌化療耐藥組中具有較高的表達，提示卵巢癌耐藥可能與AKT信號通路的異常活化存在密切關聯[11，12]。

p-AKT蛋白是57 kD的絲氨酸/蘇氨酸激酶，研究顯示，活化的p-AKT蛋白對細胞增殖具有十分重要的調控作用，AKT蛋白能夠有效促進下游蛋白的合成與活化，且能夠促進mTOR蛋白的磷酸化，進而促進細胞周期蛋白D的轉錄與轉譯;通過其他研究可知，在腫瘤細胞的增殖與遷移過程中，p-AKT蛋白信號通路也具有重要的參與作用。患者之所以無法獲得良好的預后效果，原因在于紫杉醇對卵巢癌與乳腺癌存在較高的耐藥性[13～16]。

當前的研究成果多集中于細胞研究方面，關于在腫瘤組織及其腫瘤微環境中涉及到的機制方面并未有過多研究[17，18]。通過對研究結果進行的總結顯示，mTOR/p70S6K信號通路的激活會在較大程度上影響化療療效，與化療耐藥存在密切關聯[19，20]。本研究顯示，p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中的陽性表達率明顯高于敏感組織，提示其可作為預測耐藥發生的標志，但依然需要加強研究，以便能夠獲得更加準確的結果。

綜上所述，本研究認為pAKT-mTOR-p70S6K信號通路中p-AKT蛋白、mTOR蛋白、p70S6K蛋白在卵巢癌化療耐藥組織中具有顯著較高的陽性表達率，可作為重要的預測標志。但依然需要進一步的深入研究，以便能夠獲得更加準確的研究結果，便于為臨床治療提供可靠保障。

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（收稿日期：2021-06-25）