下調lncRNA-MALAT1表達對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用

樊帥帥 宋磊軍 藺 聰 劉 揚

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischaemic brain damage,HIBD）是臨床常見病，預后較差。研究發現，lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA-MALAT1）下調明顯促進小鼠缺血性腦卒中后血管新生[1]。腦源性神經營養因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）及其受體原肌球蛋白相關激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）信號通路與神經細胞生長、凋亡密切相關，且該通路已被證實參與HIBD的調控[2]。本研究抑制lncRNAMALAT1表達新生大鼠HIBD模型的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SPF級7 d齡SD大鼠40只（雌雄各半，體質量在12～16 g），購自鄭州大學實驗動物中心[許可證號SCXK（豫）20180001，倫理批號IACUC20190525001]。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、lncRNA對照組、silncMALAT1組，每組10只。

1.2 模型制作 以Rice-Vannucci法建立新生大鼠HIBD模型[3]。吸入2%七氟醚維持麻醉，永久結扎左側頸總動脈（假手術組僅穿線不結扎），蘇醒后繼續喂養2 h，置于有機玻璃缺氧箱，持續輸入含8%O2、92%N2的混合氣體，缺氧2 h，觀察大鼠行為，出現夾尾、尖叫、自發左轉圈，則建模成功。模型組造模失敗2只，lncRNA組失敗2只，silncMALAT1組失敗1只，最終35只大鼠納入研究：假手術組10只，模型組8只，lncRNA對照組8只，silncMALAT1組9只。

1.3 給藥方法 建模成功后2 h，2%七氟醚麻醉，大鼠腦立體定位儀標記左側側腦室[4]。lncRNA對照組、silncMALAT1組緩慢推注空載體重組腺病毒、silnc-MALAT1各5μl（病毒滴度為2.5 ×1013pfu/L，上海吉瑪制藥技術有限公司提供）。假手術組、模型組推注5μl生理鹽水。停針1 min后緩慢退針，骨臘封閉。

1.4 Morris水迷宮試驗評估空間學習和記憶能力[5]造模后7 d進行1次適應性訓練，造模后8～11 d進行定位巡航試驗，記錄90 s內登陸安全平臺的時間即為逃避潛伏期，若90 s內未找到則引導至安全平臺，停留30 s，記錄為90 s。造模后12 d撤去安全平臺，記錄90 s內的游泳軌跡，分析目標象限停留時間及穿越目標象限內安全平臺的次數。

1.5 TUNEL染色檢測海馬神經元凋亡情況Morris水迷宮測試次日處死大鼠，迅速分離海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，制作4μm冠狀位切片。按照TUNEL試劑盒（美國Roche公司）說明書操作，DAB顯色，蘇木精核染，封片，顯微鏡下觀察細胞核染棕黃色或黃色顆粒則為凋亡細胞，記錄每平方毫米凋亡細胞數。見圖1。

1.6 實時定量PCR法檢測mRNA的表達 取海馬組織70 mg，采用Trizol試劑提取組織總RNA，逆轉錄獲得cDNA，再采用SYBR Green I實時PCR試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司）進行實時定量PCR。以β-actin為內參，以2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.7 免疫印跡法檢測蛋白表達 取海馬組織50 mg，組織裂解液冰上裂解30 min，4℃預冷，16 099.2 g離心15 min，取上清液測定總蛋白濃度。取10μg待測蛋白和40μg上樣緩沖液混勻，置于沸水中10 min，16 099.2 g心10 min，進行SDS-PAGE電泳，經轉膜、封閉、兔抗大鼠BDNF、TrkB單抗一抗（美國Abcam公司）、HRP標記的二抗孵育（美國Abcam公司），顯影、曝光，分析并計算目的蛋白與內參β-actin灰度值比值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件分析；計量資料均以x±s表示，采用單因素方差分析和SNK-q檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA-MALAT1對HIBD大鼠學習和記憶功能的影響Morris水迷宮試驗結果顯示，與假手術組相比，模型組、lncRNA對照組目標象限停留時間和穿越平臺次數均明顯減少（P＜0.05 ），模型組和lncRNA對照組之間無統計學差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對照組相比，silncMALAT1組目標象限停留時間和穿越平臺次數均明顯增加（P＜0.05 ）。見表1。

表1 Morris水迷宮實驗分析下調lncRNA-MALAT1表達對新生大鼠HIBD后學習和記憶功能的影響

圖1 TUNEL染色分析新生大鼠缺氧缺血腦損傷后海馬神經元凋亡情況

表2 下調lncRNA-MALAT1表達對新生大鼠HIBD后海馬組織mRNA表達量的影響

圖2 下調lncRNA-MALAT1表達對新生大鼠HIBD后海馬組織蛋白表達量的影響

2.2 lncRNA-MALAT1對HIBD大鼠海馬神經元凋亡的影響 與假手術組[（24.20 ±2.31 ）個/mm2]相比，模型組[（146.00 ±12.14 ）個/mm2]、lncRNA對照組[（143.60 ±12.54 ）個/mm2]海馬神經元凋亡數量明顯增加（P＜0.001 ），模型組和lncRNA對照組之間無統計學差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對照組相比，silncMALAT1組[（71.40 ±8.06 ）個/mm2]海馬神經元凋亡數量明顯減少（P＜0.05 ）。

2.3 lncRNA-MALAT1對HIBD大鼠海馬BDNF/TrkB信號通路的影響 與假手術組相比，模型組、lncRNA對照組BDNF、TrkB、ERK1/2 mRNA和蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.05 ），模型組和lncRNA對照組之間無統計學差異（P＞0.05 ）。與lncRNA對照組相比，silncMALAT1組BDNF、TrkB、ERK1/2 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05 ）。見表2、圖2。

3 討論

HIBD的發病機制復雜。研究顯示，HIBD后神經元及星形膠質細胞最先受到損害，累及神經元軸突及微血管功能系統，進一步損害神經信號傳導功能。應用最廣泛的HIBD動物模型為Rice-Vannucci法制作的模型，該模型與臨床HIBD病理基礎相似，與完全缺氧法制作的模型相比，可有效降低死亡率，且成模一致性較高[3]。本文83.33 %的新生大鼠出現異常神經行為學表現，提示建模成功率高。

本研究發現，silncMALAT1組大鼠海馬組織lncRNA-MALAT1表達量降低、海馬神經元凋亡數減少，目標象限停留時間延長，穿越平臺次數增多，說明下調lncRNA-MALAT1可抑制HIBD新生大鼠的海馬神經元凋亡，改善學習和記憶功能。小動脈側支循環的建立對糾正HIBD至關重要，而多種lncRNA在血管新生方面發揮重要調控作用。有研究表明，缺氧可促進大鼠腦組織微血管內皮細胞lncRNA-MALAT1表達上調，參與調節缺氧性腦損傷，但具體調控機制不明[6]。本研究silncMALAT1組海馬組織BDNF、TrkB mRNA和蛋白表達量，以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均降低，說明新生大鼠HIBD發病機制可能與激活BDNF/TrkB信號通路介導的海馬神經元凋亡有關。TrkB與BDNF結合后可發生二聚體化，從而磷酸化激活下游ERK1/2信號通路，參與調控細胞凋亡。Atif等[7]研究表明，BDNF/TrkB信號通路與小鼠HIBD后急性行為性癲癇和腦梗死面積減少有關。研究發現，下調lncRNA-MALAT1可抑制脂多糖誘導的小膠質細胞活化，參與調控腦內炎癥反應[8]。這說明lncRNA-MALAT1可能與海馬區BDNF/TrkB信號通路存在相互作用，抑制lncRNA-MALAT1表達可抑制BDNF/TrkB信號通路，從而調控HIBD進程。

總之，下調lncRNA-MALAT1表達對新生大鼠HIBD具有保護作用，可能與抑制BDNF/TrkB信號通路有關。