新時代視域下循環(huán)游離DNA在肺癌ATM基因多態(tài)性位點中的應用

●彭 華 張式一 何 莉

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，發(fā)病機制尚未十分明確，肺癌的發(fā)生發(fā)展對人們的健康造成嚴重的威脅。大多數(shù)腫瘤因缺乏有效的早期診斷手段，當被查出時大多發(fā)生了轉移并發(fā)展到中晚期，錯過了最佳的治療時機，導致病人的存活率下降。那么早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療顯得非常重要[1]。循環(huán)游離DNA是一種靈敏度高、特異性強的分子標志物用于腫瘤的檢測和預后檢測，因此需要靈敏度高和特異性好易操作的方法來提高檢出率。應用外周血游離DNA樣本的檢測是近年來新興的腫瘤診斷技術，其呈現(xiàn)出取材方便、容易檢測及非侵入性等諸多優(yōu)勢[2]，有利于臨床指導早期診斷，本研究擬采用SNP敏感性分子開關[3]技術對肺癌ATM基因rs175048、rs227060兩位點多態(tài)性進行檢測，為進一步提高肺癌早期診斷效果，為肺癌早期預警和發(fā)病風險評估提供理論基礎。

一、材料與方法

1.材料。本研究納入2021年10月到2022年3月收集衡陽地區(qū)某醫(yī)院樣本，在患者知情同意下，采集肺癌患者血液120例，男76例，女44例，正常對照組為健康人群120例，男60例，女60例。非小細胞肺癌98例，小細胞肺癌22例，所有患者均為原發(fā)性肺癌，患者年齡均在45～79歲之間。

2.實驗方法。采集外周靜脈血2ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用上海天根生物工程有限公司提供的試劑盒，提取外周血游離DNA，-20°保存。采用SNP敏感性分子開關（on-off switch）技術對兩位點進行基因分型檢測，引物設計：rs175048A/T 正向引物 1(F1)5’-TGCCTAGAAAATAAGCTA-3’，正向引物 2(F2)5’TGCCTAGAAAATAAGCAA-3’,反向引物(R)5’-TCAACACTGCATTACCTC-3’；rs227060C/T 正向引物 1(F1)5’-AATACTCAAAAGCTTCTC-3’，正向引物 2（F2）5’-AATACT CAAAAGCTTCTT-3’，反向引物（R）5’-TACTTCCATTATTTCTT G-3’。所有引物均由上海生物工程公司合成。聚合酶鏈反應體系（PCR）：采用25ul反應體系，包括模板外周血游離DNA 1.5ul、正反向引物各1ul、公共引物1ul、去離子水9ul、2*Pfu Mix 12.5ul。反應條件:94℃預變性3min,94℃變性30s,55℃退火30s，72℃延伸30s,共35個循環(huán),最后 72℃延伸 5min，取PCR產(chǎn)物5ul用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

二、結果

1.提取外周血游離DNA。將收集的肘正中靜脈血采用外周血游離DNA試劑盒提取游離DNA，用紫外分光光度計測量其濃度，濃度均在1.7～2.0之間，然后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測游離DNA的質量，條帶清晰，無雜帶。檢測完剩余的DNA保存于-20°備用。見圖1。

圖1 外周血游離DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

2.SNP敏感性分子開關技術對ATM基因rs175048、rs227060兩位點檢測。采用SNP分子開關技術對ATM基因rs175048、rs227060兩位點進行檢測分型，根據(jù)PCR產(chǎn)物有和無的現(xiàn)象，進行特異性擴增，擴增得到目的片段，PCR產(chǎn)物長度分別為167bp和331bp。rs175048位點F1為野生模板檢測引物，F(xiàn)2為突變模板檢測引物，結果發(fā)現(xiàn)AA純合子電泳后只出現(xiàn)與F1配對的1個目的片段，TT純合子只出現(xiàn)與F2配對的1個目的片段，然而AT雜合子則出現(xiàn)與F1、F2配對的2個目的片段。純合子AA（25例）、TT（38例）、雜合子AT（57例）；rs227060位點F1為野生模板檢測引物，F(xiàn)2為突變模板檢測引物，結果發(fā)現(xiàn)CC純合子電泳后只出現(xiàn)與F1配對的1個目的片段，TT純合子只出現(xiàn)與F2配對的1個目的片段，而CT雜合子則出現(xiàn)與F1、F2配對的2個目的片段。純合子CC（44例）、TT（14例）、雜合子 CT（62例）；在肺癌樣本檢測中發(fā)現(xiàn)雜合子檢出率明顯高于純合子。

三、討論

血液中游離DNA是一種游離于細胞外的DNA，多種病理狀態(tài)下血中游離DNA的水平和組成會發(fā)生改變。目前多數(shù)研究表明腫瘤患者外周血液DNA水平不僅明顯高于正常人[4-5]，且血液游離DNA具有與腫瘤組織DNA一致的基因改變類型[6-7]。血液游離DNA產(chǎn)生的生物學機制較為復雜，除正常細胞的衰老死亡之外，主要來源于腫瘤細胞壞死凋亡后擴散以及增生活躍腫瘤細胞的釋放。隨著腫瘤分子生物學的深入研究，血液游離DNA結合各類分子生物學檢測技術被認為是腫瘤早期診斷和預后判斷的有力手段。

目前世界范圍內檢測基因位點突變的方法多種多樣，主要有DNA序列分析、PCR擴增線粒體DNA片段、限制性內切酶分析、變性高壓液相色譜分析，SNP突變敏感性分子開關技術是一種快速、靈敏、經(jīng)濟、高效、可靠的突變檢測方法，具有典型特點：（1）耗時費力少，整個DNA提取；（2）檢測成本低，經(jīng)濟實用；（3）檢測程序簡單，不需要專門專業(yè)人員操作；（4）該技術表現(xiàn)配對引物被延伸，不配對引物不延伸的有或無的二元化效果。

本研究擬采用SNP敏感性分子開關技術對120例肺癌患者ATM基因rs175048、rs227060多態(tài)性位點檢測，結果顯示rs175048位點共檢測出AA、AT、TT三種基因型，其中AT基因型檢出率57例；rs227060位點共檢測出CC、CT、TT三種基因型，其中CT基因型檢出率62例，發(fā)現(xiàn)雜合子檢出率明顯高于純合子。然而有學者研究發(fā)現(xiàn)[8]，雜合子是腫瘤患者基因型中常見的現(xiàn)象，與本研究結果相符，針對肺癌ATM抑癌基因rs175048、rs227060兩位點雜合子檢測發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)游離DNA中檢測雜合子可作為肺癌患者的預后判定指標，為肺癌早期預警和發(fā)病風險評估提供理論基礎，可作為判斷肺癌患者的病情變化和診斷的良好輔助指標，此方法可廣泛應用于臨床。