苦參堿對假絲酵母菌陰道炎大鼠的藥效及其局部免疫功能的影響

楊 筱，張艷榮，喬志遠，郭紀芬

(鄭州工業應用技術學院，河南 鄭州 451100)

假絲酵母菌陰道炎是一種常見真菌感染性疾病，主要臨床表現為豆腐渣樣白帶，外陰瘙癢，陰道分泌物黏稠等[1]。據報道約75%的女性患過假絲酵母菌陰道炎，其中5%～10%出現反復發作，久治難愈[2]。由于該病發病率高、易復發，嚴重影響女性身心健康。目前，假絲酵母菌陰道炎治療主要有伊曲康唑、氟康唑等廣譜類抗真菌藥物，此類藥物雖然可對假絲酵母菌陰道炎有治療效果，但易產生惡心、嘔吐、過敏反應、肝毒性等不良反應，此外長期使用易產生耐藥性[3]。因此研究假絲酵母菌新型治療藥物為臨床所需。苦參堿是傳統中藥苦參的活性成分，具有抗炎、抗真菌、抗皮膚纖維化等功效[4]。據報道，苦參堿對細菌性陰道炎有治療效果[5]。但苦參堿對假絲酵母菌陰道炎療效尚未探明且機制研究較少。因此本研究探索苦參堿對假絲酵母菌陰道炎大鼠的治療作用及其局部免疫功能變化，為苦參堿在臨床使用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物與菌種 48只SPF級SD雌鼠，7～9周齡，體質量180～220 g，購自北京維通達生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(京)2019-0002。假絲酵母菌購自中國微生物菌種保藏中心ATCC10231。

1.2 試劑與藥物 苯甲酸雌二醇購自北京華業寰宇化工有限公司(批號1904125)；鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司(批號20190 511A)；沙堡氏葡萄糖瓊脂培養基購自上海誠竺生物科技有限公司(批號190528001)；大鼠白介素1β(interleukin-1 β，IL-1β)、白介素4(interleukin-4，IL-4)、白介素17 A(interleukin-17 A，IL-17 A)、干擾素γ(interferon-γ，INF-γ)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(批號191204、190518、190714、190611、190513、190812)；蘇木素伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司(批號20190416)。

1.3 儀器 Multiskan Sky型酶標儀購自美國Thermo公司；RCK-40C型生物顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司；HZQ-A型恒溫搖床購自蘇州威爾實驗用品有限公司。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥 48只7～9周齡SPF級SD雌鼠于造模前皮下注射0.5 mg苯甲酸雌二醇，隨機挑選40只大鼠造模，造模大鼠在苯甲酸雌二醇皮下注射后于陰道內注入50 μg鏈霉素，每天1次，在上午進行，共3 d，余下8只大鼠記作正常組。挑取白假絲酵母菌單菌落接種于液體培養基中，35 ℃搖床培養24 h，離心后使用無菌生理鹽水重懸浮，經鑒定為白假絲酵母菌菌絲相，將白假絲酵母菌孢子密度調整為5×108/mL，向造模大鼠陰道中灌入20 μL菌液，正常組陰道接種等體積無菌生理鹽水。將造模大鼠隨機分為5組，分別為模型組、氟康唑組及苦參堿高、中、低劑量組。苦參堿高、中、低劑量組分別灌胃苦參堿200、100、50 mg/kg；氟康唑組灌胃100 mg/kg氟康唑；模型組和正常組灌胃等體積無菌生理鹽水。每天1次，連續21 d。

2.2 觀察大鼠精神狀態及陰道分泌物情況 觀察各組大鼠精神狀態及陰道分泌物情況，并對大鼠精神狀態進行評分，活潑好動記作0分；反應稍遲且自主活動減少記作1分；精神萎靡、四肢蜷縮、倦怠懶動記作2分；萎靡不振且對抗性、攻擊性行為消失記作3分。

2.3 陰道灌洗液真菌菌落計數 取100 μL無菌生理鹽水沖洗陰道5～8次，得陰道灌洗液，取10 μL灌洗液，平板涂布法接種于沙堡氏固體培養基，37 ℃培養48 h后，對真菌菌落進行計數。

2.4 HE染色觀察大鼠陰道組織病理學 頸椎脫臼法處死大鼠，取大鼠陰道組織，使用4%甲醇溶液固定24 h，二甲苯透明化處理，石蠟包埋。將組織蠟塊切取4 μm厚切片，脫蠟復水后，使用HE染色試劑盒染色，于光鏡下觀察組織病變并進行病變程度評分。黏膜光滑無壞死、充血、水腫、炎性浸潤為0分；黏膜上皮無壞死，黏膜充血但未見炎性滲出物記作1分；黏膜上皮出現壞死、充血、水腫，但未見炎性浸潤記作2分；黏膜上皮出現壞死灶，黏膜下充血、水腫，并有少量炎性浸潤記作3分；黏膜上皮壞死，黏膜充血、水腫，炎性細胞浸潤嚴重記作4分。

2.5 ELISA法檢測大鼠陰道組織中細胞因子水平 取大鼠陰道組織，研磨勻漿，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書加樣并設置標準蛋白樣品。經過一抗、二抗孵育后，加底物顯色，終止顯色后，立即于酶標儀450 nm波長處讀取光密度(OD)值。依照標準蛋白濃度繪制的標準曲線計算樣本中目的蛋白水平。

2.6 ELISA法檢測大鼠陰道灌洗液中sIgA、IgG水平 按照“2.3”項下方法得陰道灌洗液，取100 μL大鼠陰道灌洗液，按照ELISA試劑盒說明書檢測sIgA、IgG水平。

3 結果

3.1 苦參堿對大鼠陰道分泌物觀察、精神狀態評分、真菌菌落形成數量和陰道組織病變程度評分的影響 實驗過程中，正常組大鼠未表現出明顯異常；模型組大鼠在接種假絲酵母菌后相繼出現煩躁、外陰紅腫與分泌物增加；苦參堿各劑量組和氟康唑組各癥狀均出現好轉，其中苦參堿高劑量組和正常組情況最接近。

模型組、氟康唑組和苦參堿各劑量組大鼠精神狀態評分、真菌菌落形成數量、陰道組織病變程度評分均高于正常組(P<0.01)；氟康唑組和苦參堿各劑量組均低于模型組(P<0.01)；苦參堿低劑量組上述指標均高于氟康唑組(P<0.01)；苦參堿高劑量組上述指標均低于氟康唑組(P<0.01)。見表1。

正常組大鼠陰道組織未見明顯異常；模型組大鼠陰道組織可見黏膜上皮細胞明顯角化增厚，可見明顯炎性細胞浸潤，表層可見卵圓形孢子；氟康唑組和苦參堿各劑量組大鼠陰道組織病理學均出現好轉，其中苦參堿高劑量組與正常組病理學較相似。見圖1。

3.2 苦參堿對大鼠陰道組織及血清中IL-1β、IL-4、IL-17A、INF-γ水平及IFN-γ/IL-4比值的影響 模型組、氟康唑組、苦參堿各劑量組大鼠陰道組織及血清IL-1β、IL-4、IL-17 A、INF-γ水平均高于正常組(P<0.01)；氟康唑組和苦參堿各劑量組上述指標均低于模型組(P<0.01)；苦參堿組低劑量組上述指標均高于氟康唑組(P<0.01)；苦參堿高劑量組上述指標均低于氟康唑組(P<0.05，P<0.01)；模型組、氟康唑組、苦參堿各劑量組大鼠陰道組織及血清IFN-γ/IL-4比值均低于正常組(P<0.01)；氟康唑組和苦參堿各劑量組IFN-γ/IL-4比值均高于模型組(P<0.01)；苦參堿組低劑量組IFN-γ/IL-4比值低于氟康唑組(P<0.01)；苦參堿高劑量組IFN-γ/IL-4比值高于氟康唑組(P<0.01)。見表2～3。

表1 各組大鼠精神狀態評分、真菌菌落形成數量、陰道組織病變程度評分

圖1 各組大鼠陰道組織病理學觀察(HE，×200)

3.3 苦參堿對大鼠陰道灌洗液中sIgA、IgG水平的影響 模型組、氟康唑組、苦參堿各劑量組大鼠陰道灌洗液中sIgA、IgG水平均高于正常組(P<0.01)；氟康唑組和苦參堿各劑量組上述指標均低于模型組(P<0.01)；苦參堿低劑量組上述指標水平均高于氟康唑組(P<0.01)；苦參堿高劑量組上述指標水平均低于氟康唑組(P<0.01)。見表4。

表2 各組大鼠陰道組織中IL-1β、IL-4、IL-17 A、INF-γ水平及IFN-γ/IL-4比值

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-17 A、INF-γ水平及IFN-γ/IL-4比值

表4 各組大鼠陰道灌洗液中sIgA、IgG水平

4 討論

氟康唑常用于治療真菌性陰道炎且有一定效果，因此本研究使用氟康唑作為陽性對照藥物具有可行性，但是長期使用該藥物可誘發耐藥，加大了該病治療難度[6]，因此，尋找新型藥物有重要意義。

本研究首先皮下注射苯甲酸雌二醇建立假動情期，并對造模大鼠予以硫酸鏈霉素陰道注射，可破壞正常大鼠的陰道菌群結構，與既往報道中的方法相符[7]，而后對造模大鼠陰道內灌入白假絲酵母菌孢子菌液，可確保造模成功。苦參堿是豆科植物苦參的有效成分，具有抗菌消炎功效。據報道，苦參堿對陰道炎有治療效果[8]。此外，苦參堿可通過抑制真菌生物膜形成，在體外實驗中表現出抗真菌活性[9]。本研究觀察發現，苦參堿對假絲酵母菌陰道炎有療效，且高劑量苦參堿的作用更佳。假絲酵母菌感染可引起陰道內環境紊亂，進而誘發炎癥反應[10]。據報道，假絲酵母菌陰道炎患者血清中可檢測出IL-1β水平增高[11]，本研究大鼠實驗結果與上述報道一致。細胞免疫紊亂在假絲酵母陰道炎中發揮主要作用。有研究表明，在假絲酵母菌陰道炎小鼠陰道組織中可檢測出Th1、Th2型細胞因子[12]，假絲酵母菌感染患者Th2細胞活性高于正常人[13]。INF-γ/IL-4比值可反映Th1/Th2細胞因子平衡，Th1/Th2比值降低可反映Th1/Th2失衡[14-15]。本研究結果表明，苦參堿可調節Th1/Th2平衡。陳曦等[16]研究顯示，對外陰陰道假絲酵母菌病模型大鼠予以康婦消炎栓，發現IL-17水平下降，本研究結果與該報道相符。

體液免疫在假絲酵母菌陰道炎中發揮輔助協同保護作用。Th1和Th2均可輔助B細胞產生IgG等抗體，影響體液免疫水平[17]。有研究表明，表皮細胞可產生IgG，抵抗病原體入侵，維持表皮屏障功能[18]。據報道，陰道上皮可分泌IgG，在抗假絲酵母菌感染過程中發揮作用[19]。sIgA是黏膜免疫系統主要成分，是陰道造模抗假絲酵母菌感染的主要抗體之一[20]。本研究結果顯示，苦參堿可促進IgG、sIgA恢復正常水平。

綜上所述，苦參堿對假絲酵母菌陰道炎有效，可減輕陰道組織病變，緩解陰道組織炎癥，調節Th1/Th2平衡與黏膜免疫反應有關，還可恢復sIgA、IgG抗體水平。此外苦參堿對假絲酵母菌陰道炎大鼠的效果呈劑量依賴性，顯示出苦參堿在假絲酵母菌陰道炎患者臨床治療中有良好的價值，但是苦參堿對假絲酵母菌陰道炎大鼠發揮療效的具體作用機制及其在臨床治療中的有效性、安全性尚不清楚，仍需要進一步探討。