不同土地整治類型新增耕地土壤微生物群落特征研究

朱奕豪，李青梅，劉曉麗，李娜，宋鳳玲，陳為峰*

1. 山東農業大學資源與環境學院，山東 泰安 271018；2. 山東省土地發展集團有限公司，山東 濟南 250014；3. 山東省國土空間生態修復中心，山東 濟南 250014；4. 泰安市國土空間生態修復中心，山東 泰安 271099

土地整治包含土地整理、復墾和開發，一般采用工程、生物等措施對散亂、荒廢、退化及配置不合理、未被充分利用的土地實施綜合治理與深度開發，是提高土地利用率和產出率、改善農業生產條件和土地生態環境、實現土地資源可持續利用和促進土地生態環境良性循環的一種高效土地管理工具（Stańczuk-Ga?wiaczek et al.，2018；王軍等，2018；陳坤秋等，2020）。近年來，土地綜合整治為國家耕地“占補平衡”戰略和糧食安全做出了重要貢獻，也成為驅動耕地質量變化的一項重要因素（李肖肖等，2019；趙瑞等，2019）。

土地整治工程多采用挖高填低、表土剝離等方式進行土地平整與地塊合并，在改善農業生產條件、優化國土空間布局的同時，這一過程不可避免地會對土體構型和土壤質量產生影響，不僅影響土壤理化性狀，還會對土壤微生物群落造成一定干擾（Djanibekov et al.，2018；Legrand et al.，2018），而土壤微生物在維持農田生態系統穩定中發揮著重要作用，它們對外界干擾極為敏感，其中細菌因在土壤微生物數量中占有絕對優勢并可通過固氮和有機質分解、轉化等方式提高土壤養分含量，從而改善土質以達到作物增產的效果（Wang et al.，2018；林耀奔等，2019）。同時，土壤理化性狀變化也會造成土壤微生物群落結構的改變。研究表明，通過國土綜合整治及強化后續管控，土壤質量會得到良好的改善（Ertun? et al.，2018；林耀奔等，2019；李肖肖等，2020），但也有報道證實工程配套型土地整治短期內對土壤質量和作物長勢存在不利影響（李肖肖等，2019）。

目前，土地整治涉及土壤微生物研究主要集中于工礦區土地復墾（李肖肖等，2020；施昊坤等，2020；馬靜等，2021；原野等，2021）、新增耕地培肥（林耀奔等，2019；羅友進等，2020）、整治質量評價（林耀奔等，2019；趙瑞等，2019）等方面，而不同來源新增耕地土壤微生物群落特征的影響尚缺乏深入研究。探索不同類型新增耕地微生物種群的組成變化、厘清微生物群落分布的主控因素，對新增耕地后期管護至關重要。為此，本研究選取山東省泰安市34個土地整治項目（工礦復墾、占補平衡）作為研究對象，涉及棕壤、褐土、潮土不同土壤類型，分布在丘陵、山地、平原不同地貌區域，選擇泰安區域，基本可作為山東開展工礦復墾和占補平衡項目補充耕地區域的典型代表區，以此作為本研究選擇區域的切入點，測定土壤理化性狀、三大類微生物數量，并利用高通量測序技術測定土壤細菌16 S rRNA，探索不同類型新增耕地土壤微生物群落組成變化，揭示土壤微生物群落變化的關鍵影響因子，為新增耕地培肥和養護提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區及樣品采集與處理

研究區泰安市位于魯中山區，地理位置116°20—117°59′E，35°38′—36°28′N，屬溫帶大陸性半濕潤季風氣候區，雨熱同季，具有良好的環境條件和悠久的農業歷史，境內擁有多種地貌類型，如山地、丘陵、平原、洼地、湖泊等，豐富的地形便于作物的多樣化種植，但因地形變化導致地塊不集中、耕地不成片的現狀限制了規模化的土地經營與流轉。因此，通過土地平整、地塊合并、水田改造、改善灌排及生態護坡等措施于一體的土地整治工程可有效緩解土地零散的難題，保障土地集中連片、規模經營，極大提高了機械使用率、土地利用率與土壤產能。

本文選擇對目前土地整治項目類型中常涉及大規模土壤重構的工礦復墾項目（GK）和占補平衡項目（ZB）進行研究，這兩類新增耕地是目前山東省新增耕地指標的主要類型，是社會投資項目的重點，其新增耕地質量問題，也是社會關注的焦點。兩類土地整治項目中的土地整理均涉及到客土回填，工礦復墾項目客土一般在60—80 cm，占補平衡項目客土一般在30 cm。2021年10月對泰安市34個項目（GK項目18個，ZB項目16個）開展調查研究，從項目區附近選取非土地整治形成的農田作為對照（CK），采樣項目區分布如圖1，每個樣地采樣時均采用五點法采集0—20 cm的表層土，每個項目區取20個樣點，5個樣點混勻成一份土樣，共計208份，現場篩除碎石、枯落物及其他雜物后放于無菌密封塑料袋中，低溫保存運輸至實驗室。之后土樣分為3份，一份土樣風干后過篩待測，用于土壤理化性狀測定；第2份根據實驗需求以鮮土方式保存用于土壤細菌、真菌、放線菌測定；第 3份儲存于?80 ℃冰箱用于土壤細菌測序（從工礦復墾、占補平衡及對照耕地各選一個樣地取樣）。

圖1 采樣項目區位置圖Figure 1 Location map of sampling project area

1.2 土壤理化性質測定

采用環刀法測定土壤容重（BD）與含水量（SWC）；電極電位法測定土壤pH值；重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機質（SOM）；半微量凱氏定氮法測定土壤全氮（TN）；碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷（AP）；pH 7.0醋酸銨浸提-火焰光度計法測定土壤速效鉀（AK）（鮑士旦，2000）。

1.3 土壤微生物測定

細菌培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基；放線菌培養基采用改良高氏培養基；真菌培養基采用馬鈴薯葡萄糖培養基；3種細菌均采用稀釋平板計數法計算（吳金水等，2006）。

1.4 DNA提取及高通量測序

使用土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國）進行土壤微生物總DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對抽提總DNA純度和濃度進行檢測。對細菌16S rRNA基因的V3—V4區域進行PCR擴增,引物序列為：338F和806R。PCR擴增采用高保真 DNA聚合酶和 ABI GeneAmp?9700型的 PCR儀。PCR擴增體系包括：10×快速Pfu DNA聚合酶（FastPfu）緩沖液2 μL，脫氧核苷三磷酸 dNTPs（2.5 mmol·L?1）2 μL，引物（5 μmol·L?1）0.8 μL，rTaq 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板10 ng和無菌水補至總體系20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增結果進行 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切目的片段并且回收PCR產物。PCR擴增產物回收后進行純化和定量后形成測序文庫，對測序文庫質檢合格后使用Illumina公司的Mi Seq PE 300平臺進行雙向測序。將土壤樣品保存在干冰中送至上海美吉生物科技有限公司進行土壤微生物高通量測序。

1.5 統計分析

采用QIIME進行土壤細菌群落相關指標分析，采用 Mothur（1.30.2）軟件計算 α多樣性指數（Shannon、Simpson、Ace、Chao1和Coverage等），采用SPSS 22.0對土壤理化性狀進行顯著性分析及對土壤理化性狀與細菌、真菌、放線菌進行相關性分析，采用Canoco 5.0對土壤群落組成與土壤理化性狀進行冗余分析（RDA）。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性狀

表1總結了工礦復墾（GK）、占補平衡（ZB）兩類新增耕地與對照耕地（CK）土壤的基本屬性。結果顯示，除高新區土壤偏酸性（pH<6.5）外，其余縣區大部分土壤偏堿性。兩類新增耕地與對照耕地土壤容重大小為：GK>ZB>CK（岱岳區、肥城市、高新區）；ZB>GK>CK（新泰市、寧陽縣、東平縣），與對照耕地相比，岱岳區、肥城市、高新區、新泰市、寧陽縣和東平縣GK項目土壤容重分別增大了19.59%、17.33%、21.68%、7.38%、22.96%和10.00%，ZB項目土壤容重分別增大了 15.54%、8.67%、13.29%、10.53%、25.19%和16.43%。GK、ZB、CK土壤含水量的變化范圍分別為 15.85%—22.03%、13.66%—23.14%、18.07%—26.25%。兩類新增耕地土壤有機質、氮磷鉀含量均顯著低于對照耕地，其中全氮和有效磷含量變化規律明顯，均表現為GK

表1 新增耕地和對照耕地土壤基本屬性Table 1 Soil basic properties of newly cultivated land and control farmland

2.2 土壤微生物數量

微生物數量與土壤質量密切相關，是反映土地恢復過程中土壤狀況的重要指標，土壤三大類微生物數量常被作為生物學指標來評價土壤肥力水平的高低。本研究中，新增耕地及對照耕地表層土壤微生物數量總體特征如表2所示，從各類微生物數量的均值來看，總體呈現出兩類新增耕地土壤細菌、放線菌數量低于對照耕地，而真菌數量高于對照耕地的趨勢。兩類新增耕地及對照耕地土壤細菌數量最大值均出現在東平縣，分別達到了11.89×105、26.22×105和 28.67×105cfu·g?1，兩類新增耕地GK、ZB土壤真菌數量最大值分別出現在東平縣（24.00×103cfu·g?1）和新泰市（21.45×103cfu·g?1）。

表2 新增耕地和對照耕地土壤微生物數量Table 2 Number of soil microorganisms in newly cultivated land and control farmland

2.3 土壤理化性狀與土壤微生物數量相關性分析

土壤理化性狀與土壤細菌、真菌、放線菌相關性分析（表3）可知，土壤細菌數量與土壤容重呈極顯著負相關關系（P<0.01），與土壤含水量、速效鉀含量及有機質、全氮、有效磷含量呈顯著正相關（P<0.05）或極顯著正相關（P<0.01）關系；土壤放線菌數量與土壤容重呈極顯著負相關（P<0.01）關系，與土壤含水量及有機質、全氮、有效磷、速效鉀含量呈極顯著正相關（P<0.01）關系；土壤真菌數量與土壤理化性狀的相關性呈現與放線菌數量相反的趨勢。

表3 土壤理化性狀與土壤細菌、真菌、放線菌相關性分析Table 3 Correlation analysis between soil physio-chemical properties and soil bacteria, fungi and actinomycetes

2.4 土壤細菌多樣性和群落組成

2.4.1 測序數據分析

基于16S rRNA高通量測序共獲得540479個有效序列，基于相似度 97%進行聚類分析，得到3604個OTUs，共34個門、107個綱、264個目、417個科、795個屬和1544個種。兩類新增耕地和對照耕地土壤共有細菌OTUs數為679，其中工礦復墾（GK-XZ）特有細菌OTUs數為124，占補平衡項目（ZB-DW）特有細菌 OTUs數為 66，對照耕地（CK）為2036（圖2）。

圖2 新增耕地和對照耕地土壤細菌組成差異Figure 2 Differences of soil bacterial composition between newly cultivated land and control farmland

2.4.2 土壤細菌α多樣性和群落組成分析

在 97%相似性水平下對兩類新增耕地及對照耕地土壤細菌進行高通量測序，結果表明各樣地土壤細菌OTUs覆蓋度均大于99%（表4），說明此次測序合理，能夠反映新增耕地及對照耕地土壤細菌群落的真實情況。工礦復墾土壤細菌Shannon指數、Ace指數和Chao1指數均大于占補平衡土壤，Simpson指數相反。與對照耕地相比，兩類新增耕地土壤細菌Shannon指數、Ace指數和Chao1指數小于對照耕地，Simpson指數大于對照耕地。兩類新增耕地土壤細菌Shannon指數、Simpson指數、Ace指數和 Chao1指數均與對照耕地差異顯著（P<0.05）。

表4 新增耕地和對照耕地土壤細菌α多樣性Table 4 The α-diversity indexes of soil bacteria in new cultivated land and control farmland

由圖3可以看出，在門分類水平上，兩類新增耕地與對照耕地的優勢菌門主要有放線菌門（20.65%—40.40%）、厚壁菌門（9.42%—34.98%）、變形菌門（10.52%—21.13%）、綠彎菌門（7.63%—33.73%）、酸桿菌門（2.07%—7.87%）、芽單胞菌門（0.49%—9.08%）、異常球菌-棲熱菌門（0.00%—10.27%）、擬桿菌門（0.51%—3.00%）、髕骨細菌門（0.74%—2.87%）、粘球菌門（0.08%—2.00%）。與對照耕地相比，兩類新增耕地土壤放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門數量低于對照耕地，厚壁菌門、芽單胞菌門數量高于對照耕地。這表明，土地整治導致的土壤生態環境改變會使得土壤細菌群落中的一些物種逐漸被某些更適應在新環境中生長的物種替代，土壤微生物群落因與土壤間的強相互關系，當其發生變化時將影響新增耕地土壤的恢復過程。

圖3 新增耕地和對照耕地土壤細菌群落組成Figure 3 Composition of soil bacterial community in newly cultivated land and control farmland

2.4.3 土壤細菌群落結構與土壤理化性狀的冗余分析

通過 RDA揭示了土壤細菌群落組成結構與土壤理化性質之間的關系，結果（表5，圖4）發現，門分類水平上，軸 1和軸 2分別解釋了變量的58.50%和20.70%，本文所選的7個土壤理化性狀的特征值共解釋了82.40%的總方差（表5）。置換檢驗的冗余分析顯示（表6），SOM對土壤細菌群落結構的影響最大（P=0.0080），單獨解釋量達52.00%。

表5 冗余分析Monte Carlo置換檢驗結果Table 5 Results of Monte Carlo permutation test

圖4 土壤細菌群落與土壤理化性狀冗余分析Figure 4 Redundancy analysis for bacterial community and soil physico-chemical

表6 新增耕地及對照耕地土壤細菌群落冗余分析Table 6 Redundancy analysis of bacterial communities in newly cultivated land and control farmland

3 討論

土壤理化性質的變化是影響微生物群落特征發生變化的主要因素，土壤微生物數量、多樣性及群落組成等群落特征均可反映土壤質量（紀立東等，2020；張振佳等，2021；周虹等，2022）。土地整治使得土壤生物和非生物因素在相互作用的過程中改變了土壤的理化性質和微生物群落（Legrand et al.，2018；Wang et al.，2018）。土地整治類型不同，土壤理化性狀存在一定差異。本研究發現，兩類新增耕地土壤pH值和土壤含水量總體上與對照耕地差異不顯著，但土壤容重、有機質及氮磷鉀含量呈現出了較大差異。兩類新增耕地土壤容重總體上顯著高于對照耕地，有機質及氮磷鉀含量顯著低于對照耕地，其中全氮、有效磷含量趨勢明顯，均為 GKZB>GK（表2），這說明土地整治工程干擾了細菌的生長繁殖，使得細菌數量發生相應變化，致使兩類新增耕地細菌數量少于對照耕地，此外工礦復墾土地土體構型變化較大，影響了土壤物質循環、能量流動及水氣熱的分布，導致細菌可利用的有效資源十分有限，嚴重制約了細菌的生長（周虹等，2022），使得工礦復墾土地細菌數量最低。細菌與土壤理化性狀的相關性分析也在一定程度上指示了土地整治新增耕地過程中土壤質地的變化。真菌群落具有強大且完整的酶系統，能夠強有力的分解復雜的有機物質，在某些不適于細菌發育的環境中，真菌因其對環境的良好適應性及耐受能力而成為有機質分解過程的主要菌群（邵志敏，2019）。同時，由于土壤真菌養分循環途徑為慢周轉方式，土壤微生物底物循環時間較長（黃春萍等，2018；沈曉琳等，2021），導致真菌在人為活動強烈干擾且貧瘠的土壤狀況下，真菌因其自身的獨特功能更易適應此種環境，造成兩類新增耕地真菌數量高于對照耕地。總之，兩類新增耕地土壤結構較差、養分含量較低，這樣的土壤環境不利于微生物生長、代謝。

利用Illumina MiSeq高通量測序技術對兩類新增耕地的土壤細菌α多樣性和群落組成進行研究，在評價土壤細菌群落多樣性時主要采用Shannon指數、Simpson指數、Ace指數及Chao1指數，Shannon和Simpson指數可以反映土壤微生物群落物種多樣性；Ace和Chao1指數可以反映土壤微生物群落中物種數量的豐富度（羅友進等，2020）。一般而言，多樣性指數越高，微生物群落結構越復雜，生態系統相對越穩定（楊君瓏等，2018）。本研究發現，兩類新增耕地土壤多樣性指數顯著低于對照耕地，造成這種差異的原因在于兩類新增耕地是通過土壤重構形成的，而重構土壤徹底改變了土壤物理結構及養分含量，導致其土壤質量遠低于對照耕地，使得作為微生物生存活動的土壤環境狀況較差及微生物生命代謝來源的養分資源缺乏，不利于某些偏好微生物的生長繁殖，致使兩類新增耕地土壤微生物多樣性較低。工礦復墾土壤細菌 Ace指數及Chao1指數高于占補平衡土壤，表明工礦復墾土壤細菌群落中物種數量的豐富度高于占補平衡土壤。兩類新增耕地與對照耕地的優勢菌門均為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門等，其他研究人員也在不同類型的土壤中發現了這些細菌優勢菌門（Wang et al.，2020；劉洋等，2016；程分生等，2021；鄭蘭香等，2021）。這一結果說明，雖然兩類新增耕地為重構土壤，但土壤中執行生態功能的優勢菌門依然存在，并表現出了較高的相對豐度，因此其本身具備土壤微生物功能恢復的構建條件。放線菌門和變形菌門細菌生態幅寬廣、環境適應強，是陸地生態系統的主要優勢類群（程分生等，2021），因此，土地整治工程中人為擾動強度大小對其優勢種群地位的影響較小。放線菌門能夠降解纖維素和幾丁質，是土壤養分供給的主要來源（李宏等，2021），本研究表明，對照耕地的放線菌門細菌相對豐度顯著高于兩類新增耕地（圖3），有機質及養分含量也高于兩類新增耕地（表1），研究結果證實了放線菌門對土壤養分的貢獻；RDA分析發現變形菌門與SOM相關性較大，該結果支持變形菌門與碳利用方面有關的結論（鄭蘭香等，2021）。兩類新增耕地中厚壁菌門細菌相對豐度顯著高于對照耕地（圖3），這是由于厚壁菌門細菌為耐受強烈的外界環境變化而進化出了較厚的細胞壁，保護自身在異常條件下可以更好地存活（鄭文玲等，2021），這也反映出了某些微生物在應對環境變化時具有相應的響應策略。

影響土壤微生物群落結構變化的環境因子多為pH、有機質/有機碳含量（Thakur et al.，2019；王鎣燕等，2019），本研究得出 SOM 含量是影響土壤微生物群落結構變化的主要因素，SOM含量能解釋細菌群落結構變化的52.00%（表6），SOM作為土壤固相部分的重要組分，與新增耕地土壤的結構、通氣、滲透及緩沖性能密切相關。土壤pH對土壤微生物群落結構的影響較為復雜，本研究中土壤pH值與細菌群落不存在顯著相關性，這可能是由于兩類新增耕地土壤pH值與對照耕地相比變化不大且差異不顯著所致（表1），另外，與土壤類型、土壤性質、人為干擾程度及采樣時間等因素間的交互作用也有一定關系。前人的研究中也會出現pH的作用不突出的情況，如丁嘉寧等（2020）對煤礦區復墾土壤研究發現，土壤全磷、有機質等是影響土壤群落結構差異的主要因素；裴廣廷等（2021）對草地土壤的研究得出微生物生物量碳和細根生物量的改變是土壤微生物群落結構變化的主要影響因素，這些研究均表明pH值并非一直是影響土壤微生物群落結構變化的主導因子。因此，土壤有機質成為兩類新增耕地重點調控的指標，今后應通過大量施加高碳基有機肥或高碳基有機改良材料的方式，快速增加土壤有機碳，從而為土壤微生物生命活動提供充足的碳源及更適宜的生存環境，有利于增加微生物數量，加速動植物殘體等有機物料的分解、轉運，最終達到新增耕地土壤質量有效改善、作物持續穩定增產的效果。

4 結論

（1）兩類新增耕地土壤容重高于對照耕地；有機質及氮磷鉀含量低于對照耕地，其中全氮和有效磷含量變化規律明顯，均為CK>ZB>GK。

（2）兩類新增耕地和對照耕地中細菌數量占絕對優勢；兩類新增耕地細菌、放線菌數量低于對照耕地，而真菌數量高于對照耕地；細菌、放線菌數量與土壤有機質及養分呈顯著正相關，真菌則相反。

（3）兩類新增耕地與對照耕地的優勢菌門均為放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門等，兩類新增耕地放線菌門相對豐度均低于對照耕地，厚壁菌門相對豐度高于對照耕地。RDA分析發現，土壤有機質是影響土壤微生物群落變化的主要因子。