蒼耳亭通過調控LOXL1-AS1/miR-520d-5p軸對白血病細胞增殖和凋亡的影響*

王丹丹 饒琦 郭彩玲 趙寅 史岑敏

(四川大學華西醫院血液內科,四川 成都 610041)

白血病是一種惡性克隆性造血干細胞疾病。由于白血病細胞增殖失控、凋亡受阻、分化障礙等原因，機體正常造血功能受到抑制，并導致貧血和免疫缺陷等嚴重癥狀。蒼耳亭是從菊科植物蒼耳Xanthiumsibiricum干燥成熟帶總苞的果實中提取的天然倍半萜內酯，具有抗癌、抗血管生成、抗炎、抗寄生蟲等作用[1-2]。研究報道蒼耳亭對宮頸癌細胞具有明顯的抑制增殖和促進凋亡作用[3]。蒼耳亭通過干擾核因子kB通路誘導非小細胞肺癌細胞G2/M周期阻滯和凋亡[4]。然而，蒼耳亭對白血病抗癌作用和機制鮮有報道。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是研究最多的非編碼類型，其通過直接或間接地調控細胞增殖、分化、凋亡和轉移等相關基因表達，具有抑癌或致癌基因功能[5-6]。lncRNA類賴氨酰氧化酶1反義RNA1(LOXL1-AS1)位于15q24.1，研究報道肺癌中LOXL1-AS1高表達明顯增強腫瘤細胞增殖和侵襲能力[7]。干擾LOXL1-AS1表達明顯抑制胃癌細胞增殖和轉移[8]。靶基因預測顯示miR-520d-5p是LOXL1-AS1的潛在靶點，有研究指出急性T淋巴細胞白血病患者中miR-520d-5p表達下調[9]。咪達唑侖通過上調miR-520d-5p表達誘導肺癌細胞凋亡[10]。然而，LOXL1-AS1是否靶向miR-520d-5p調控白血病進展并不清楚。本研究通過分析蒼耳亭對白血病細胞增殖、凋亡以及LOXL1-AS1、miR-520d-5p表達的影響，旨在探討蒼耳亭在白血病中潛在抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 白血病K-562細胞購自中國典型培養物保藏中心；RPMI-1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；蒼耳亭(純度≥98%，批號20200110)購自上海源葉生物；RNAiso Plus試劑購自大連Takara生物公司；熒光素酶報告載體、PCR引物、miR-520d-5p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)、針對LOXL1-AS1小干擾RNA(si-LOXL1-AS1)及其陰性對照(si-NC)、LOXL1-AS1過表達質粒(pcDNA-LOXL1-AS1)購自廣州銳博生物公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體(AF1186)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2兔多克隆抗體(AF6285)、Bcl相關X蛋白(Bax)兔單克隆抗體(AF1270)、山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物公司；反轉錄試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和蒼耳亭濃度篩選 將K-562細胞培養在RPMI-1640培養基中，培養基中添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，放入37℃、含5% CO2培養箱培養。取5×103個第三代對數期K-562細胞接種6孔板，分別用含0、5、15、30、60、90 μmol/L蒼耳亭[3]的培養液孵育K-562細胞24 h，每孔K-562細胞中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h后，分光光度計測定450 nm處吸光度(OD)。增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。根據增殖抑制率選擇6、20、60 μmol/L蒼耳亭進行實驗。

1.2.2 細胞轉染和實驗分組 取2×105個對數期K-562細胞接種6孔板，當細胞密度為50%時利用Lipofectamine 3000分別轉染si-LOXL1-AS1、si-NC、pcDNA-LOXL1-AS1至K-562細胞，轉染48 h采用RT-qPCR檢測LOXL1-AS1水平已驗證轉染效果。實驗分組：對照組為正常培養的K-562細胞；蒼耳亭6 μmol/L組、蒼耳亭20 μmol/L組、蒼耳亭60 μmol/L組為分別用含6、20、60 μmol/L蒼耳亭的培養液孵育K-562細胞24 h；si-NC組、si-LOXL1-AS1組為分別轉染si-NC、轉染si-LOXL1-AS1的K-562細胞；蒼耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1組為含60 μmol/L蒼耳亭的培養液孵育轉染pcDNA-LOXL1-AS1的K-562細胞24 h。每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測K-562細胞增殖 將轉染si-LOXL1-AS1、si-NC或者pcDNA-LOXL1-AS1的K-562細胞、未轉染K-562細胞以5×103個/孔密度接種96孔板，按照“1.2.2”實驗分組加入一定濃度的蒼耳亭孵育細胞24 h，隨后按1.2.1步驟測定各孔OD值，根據OD值計算增殖抑制率。每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測K-562細胞凋亡率 將各組K-562細胞重懸于100 μL的1×結合緩沖液中，細胞密度為1×106個/mL。分別取5 μL的Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)加入到述細胞懸液中，避光孵育15 min。補加400 μL的1×結合緩沖液并混合均勻。流式細胞儀檢測各組K-562細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質印記檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取各組K-562細胞總蛋白。蛋白定量后，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，設置電壓100 V，時間90 min。然后濕轉蛋白至硝酸纖維素膜上，設置電流20 mA過夜。用5%脫脂乳封閉膜2 h，4℃下用Bax抗體(1∶800)、Bcl-2抗體(1∶500)、內參GAPDH抗體(1∶2000)孵育過夜，室溫下用二抗(1∶1000)孵育1 h。洗膜后，用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。以Image J軟件測得的Bax(或Bcl-2)與GAPDH條帶灰度值比值表示Bax(或Bcl-2)蛋白相對表達量。每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達 用RNAiso Plus試劑提取各組K-562細胞的總RNA。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA、lncRNA熒光定量檢測試劑盒分別檢測LOXL1-AS1、miR-520d-5p表達。miRNA和lncRNA的相對表達量以2-ΔΔCt法計算。LOXL1-AS1：上游5′-GA TATGTTGGATGATGGA-3′，下游5′-GATATGTT GGATGGATGA-3′；內參GAPDH：上游5′-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATGGT GATGGGATTTC-3′；miR-520d-5p：上游5′-TGAGT CTACAAAGGGAAGCCC-3′，下游5′-TCTCAAAC CGTAACCCACCA-3′；內參U6：上游5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAAT TGCGT-3′。每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 使用Starbase在線數據庫預測LOXL1-AS1的靶基因，發現miR-520d-5p是其潛在靶點。將包含miR-520d-5p結合區域的LOXL1-AS1的野生(WT)序列插入熒光素酶報告質粒psiCHECK-2的下游，構建熒光素酶報告載體WT-LOXL1-AS1。將含miR-520d-5p結合位點的LOXL1-AS1序列進行突變(MUT)，構建突變型熒光素酶載體MUT-LOXL1-AS1。將上述載體分別與miR-520d-5p mimics、miR-NC共轉染K-562細胞。轉染48 h后，以海腎熒光素酶為內控，雙熒光素酶活性系統測定K-562細胞的相對熒光素酶活性。每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 不同濃度的蒼耳亭對K-562增殖的影響 采用不同濃度的蒼耳亭孵育K-562細胞，與0 μmol/L相比，5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L的蒼耳亭孵育后細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，后續選擇6 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L濃度進行實驗。見圖1。

圖1 蒼耳亭對K-562增殖的影響

2.2 蒼耳亭對K-562細胞增殖、凋亡的影響 與對照組比較，蒼耳亭(6、20、60 μmol/L)組K-562細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；隨著蒼耳亭濃度的升高，其對K-562細胞增殖、Bcl-2蛋白表達的抑制作用以及對細胞凋亡、Bax蛋白表達的促進作用逐漸增強。見圖2、表1。

圖2 蒼耳亭對K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表1 蒼耳亭對K-562細胞增殖、凋亡的影響

2.3 蒼耳亭對K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達的影響 與對照組比較，蒼耳亭(6、20、60 μmol/L)組K-562細胞LOXL1-AS1表達顯著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表達顯著升高(P<0.05)。隨著蒼耳亭濃度的升高，其對K-562細胞LOXL1-AS1表達的抑制作用和對miR-520d-5p表達的促進作用逐漸增強。見表2。

表2 蒼耳亭對K-562中LOXL1-AS1和miR-520d-5p表達的檢測

2.4 干擾LOXL1-AS1對K-562細胞增殖、凋亡的影響 si-LOXL1-AS1組K-562細胞LOXL1-AS1表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，提示轉染si-LOXL1-AS1后K-562細胞LOXL1-AS1表達受到抑制。與si-NC組比較，si-LOXL1-AS1組K-562細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 干擾LOXL1-AS1對K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表3 干擾LOXL1-AS1對K-562細胞增殖、凋亡的影響

2.5 LOXL1-AS1和miR-520d-5p靶向關系 Starbase在線數據庫預測到miR-520d-5p與LOXL1-AS1序列間存在互補結合位點(圖4)。檢測相對熒光素酶活性顯示，同與WT-LOXL1-AS1共轉染，轉染miR-520d-5p mimics后K-562細胞相對熒光素酶活性顯著低于轉染miR-NC(P<0.05)；同與MUT-LOXL1-AS1共轉染，轉染miR-520d-5p mimics后K-562細胞相對熒光素酶活性與轉染miR-NC比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

圖4 LOXL1-AS1和miR-520d-5p的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.6 過表達LOXL1-AS1對蒼耳亭處理的K-562增殖和凋亡的影響 與對照組比較，蒼耳亭組K-562細胞LOXL1-AS1表達、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，miR-520d-5p表達、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高(均P<0.05)；與蒼耳亭組比較，蒼耳亭+pcDNA-LOXL1-AS1組K-562細胞LOXL1-AS1表達、Bcl-2蛋白表達顯著升高(均P<0.05)，miR-520d-5p表達、增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 LOXL1-AS1可逆轉蒼耳亭對K-562凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表5 LOXL1-AS1可逆轉蒼耳亭對K-562抑制率糖酵解活性和凋亡的影響

3 討論

盡管白血病的治療有明顯改善，但傳統化療藥物的療效較低，多數患者復發頻繁，預后較差，死亡率仍然居高不下[11]。天然產物由于其來源廣泛、價格低廉、抗腫瘤活性良好等優勢已成為化療藥物的主要來源。近年來，蒼耳亭已被證實對多種癌細胞具有顯著的抗腫瘤活性。蔡亞云等[12]報道蒼耳亭對體內外肝癌細胞增殖和轉移具有較強的抑制作用。狄澤敏等[13]證實蒼耳亭可激活內質網應激，誘導膠質瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長。Li等[14]指出蒼耳亭可能通過激活Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路進而抑制小鼠黑色素瘤細胞增殖，抑制血管生成。本研究發現選擇6、20、60 μmol/L蒼耳亭濃度進行實驗，蒼耳亭處理后白血病細胞K-562細胞增殖抑制率顯著升高，凋亡率明顯增加。此外，促凋亡蛋白Bax表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，這與蒼耳亭的凋亡誘導作用一致。以上研究表明蒼耳亭通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡在白血病中具有抗腫瘤活性。

LOXL1-AS1是多種腫瘤進展的致癌因子，胃癌中LOXL1-AS1表達上調預示患者預后不良，并通過誘導胃癌細胞增殖、轉移加速胃癌的惡化[15]。前列腺癌中LOXL1-AS1表達增加，下調LOXL1-AS1可以抑制腫瘤細胞增殖和細胞周期進展[16]。本研究發現蒼耳亭處理顯著下調K-562細胞中LOXL1-AS1表達水平。干擾LOXL1-AS1可抑制K-562細胞增殖，下調Bcl-2表達，上調Bax表達，促進細胞凋亡，這與蒼耳亭抗腫瘤功能類似，提示LOXL1-AS1可能介導蒼耳亭抗腫瘤作用。此外，本研究發現蒼耳亭處理顯著上調miR-520d-5p水平。既往研究報道miR-520d-5p表達可能參與胃癌發生過程[17]。宮頸癌中miR-520d-5p通過靶向PTK2抑制癌細胞惡性生物學行為[18]。越來越多研究表明lncRNA可以直接與miRNA相互作用，調節miRNA表達和活性，參與多種細胞過程[19]。LOXL1-AS1通過靶向miR-423-5p參與肺腺癌發生發展[20]。本研究證實miR-520d-5p是LOXL1-AS1的直接靶點，且miR-520d-5p表達受LOXL1-AS1負向調控，提示LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸可能介導蒼耳亭的抗腫瘤作用。進一步研究表明，過表達LOXL1-AS1明顯減弱蒼耳亭處理對K-562細胞增殖、凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，基本恢復細胞增殖能力和凋亡水平，表明蒼耳亭可能通過調控LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸進而影響K-562細胞的增殖和凋亡。

4 結論

蒼耳亭可抑制白血病細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制LOXL1-AS1/ miR-520d-5p軸有關，初步揭示了蒼耳亭在白血病中的抗癌機制，為蒼耳亭作為一種有前景的白血病抗腫瘤候選藥物的開發奠定了理論基礎。