系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD3+CD56+NKT水平與Th1/Th2細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性*

高娟 邢燕 張利軍

(1.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400010)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)為常見慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今仍未完全明確。較多學(xué)者認(rèn)為免疫功能紊亂貫穿于SLE的病理過程[1-2]。自然殺傷T(NKT)細(xì)胞為異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞，同時(shí)具有NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的部分特性[3]。CD3+CD56+淋巴細(xì)胞為NKT細(xì)胞中的一員，其參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]、Graves病[5]等自身免疫性疾病的發(fā)病與進(jìn)展，而在SLE中的研究報(bào)道較少，且在SLE中的作用存在較大爭議。本研究選取112例SLE患者，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+CD56+NKT細(xì)胞的表達(dá)情況，旨在探討外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞表達(dá)與相關(guān)機(jī)制的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月～2020年12月重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院收治的112例SLE患者為SLE組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。②近半年內(nèi)未接受過免疫抑制劑、類固醇激素治療。③未合并其它自身免疫系統(tǒng)疾病。④自愿參與本研究且對(duì)研究內(nèi)容充分知情。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性感染、嚴(yán)重肝腎功能不全及惡性腫瘤者。②非SLE所致精神病。③妊娠期和哺乳期婦女。另選取同期我院體檢科健康自愿者50例為健康組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACScalibur型)，酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司，3550UV型)，小鼠抗人單克隆抗體CD3FITC、CD56-PE均由美國BD公司生產(chǎn)，二抗均購自美天旎生物科技公司，IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司，淋巴細(xì)胞分離液由加拿大Norgen Biotek生產(chǎn)，乙二胺四乙酸(EDTA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)緩沖液由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，試驗(yàn)操作均按試劑說明書執(zhí)行。

1.2.2 外周血CD3+CD56+NKT測(cè)定 采集受試者空腹靜脈血3 mL，EDTA抗凝，取5μL加入流式管，加入單抗CD3FITC、CD56-PE，室溫避光孵育 20 min，再經(jīng)PBS緩沖液洗滌2次，1200 r/min 離心(離心半徑：10 cm)10 min后收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用 Cellquest 軟件獲取并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 外周血相關(guān)細(xì)胞因子測(cè)定 取上述血液2 mL，2000 r/min離心(離心半徑：10 cm)10 min后取血清層，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清中IFN-γ、IL-4濃度，并在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

1.2.4 資料收集 收集患者SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)評(píng)分、24 h尿蛋白定量(24 hUPQ)等其他臨床參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 SLE組：男34例，女78例；年齡21～63歲，平均(28.41±6.37)歲；體質(zhì)量指數(shù)21～25 kg/m2，平均(23.05±3.28)kg/m2；病程0.5～15年，平均(5.37±1.20)年，按SLEDAI[7]評(píng)分分為非活動(dòng)期(SLEDAI<5分)72例，活動(dòng)期(SLEDAI≥5分)40例。健康組：男16例，女34例；年齡20～62歲，平均(28.26±6.51)歲；體質(zhì)量指數(shù)21～24 kg/m2，平均(23.12±3.31)kg/m2。兩組受試對(duì)象上述臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平比較 SLE組外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)及占比均較健康組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 健康組與SLE組外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平比較

2.3 SLE不同疾病活動(dòng)度CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平及其他參數(shù)比較 SLE活動(dòng)期組CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平及其占比、IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明顯低于非活動(dòng)期組(P<0.05)，而SLEDAI評(píng)分、24 hUPQ、IL-4明顯高于非活動(dòng)期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同疾病活動(dòng)度SLE患者CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平及其他參數(shù)比較

2.4 CD3+CD56+NKT與SLE臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CD3+CD56+NKT細(xì)胞與SLE患者SLEDAI評(píng)分、24hUPQ及IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.573、-0.682、-0.374，P<0.05)，而與IFN-γ無顯著相關(guān)性(r=0.016，P>0.05)，見表3。

表3 CD3+CD56+NKT與SLE臨床參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

SLE是一種好發(fā)于青壯年的自身免疫性疾病，我國SLE年新發(fā)約70～100/10萬例，呈逐年增長趨勢(shì)，其中女性患病率約為男性的10倍[8-10]。免疫系統(tǒng)紊亂為SLE的重要病理機(jī)制，病情未得到控制常累及血液、關(guān)節(jié)、皮膚等多器官系統(tǒng)，嚴(yán)重危害機(jī)體健康。目前SLE的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、自身抗體指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)及影像學(xué)檢查等，但易與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等病癥混淆，造成漏診或誤診[11-13]。隨著近年來對(duì)SLE免疫機(jī)制研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞與SLE的發(fā)病關(guān)系密切，有望成為SLE診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估的新指標(biāo)[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，SLE組外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)及占比均明顯小于健康組，且SLE活動(dòng)期CD3+CD56+NKT細(xì)胞水平及其占比明顯低于非活動(dòng)期組，同時(shí)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CD3+CD56+NKT細(xì)胞與SLE患者SLEDAI評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示CD3+CD56+NKT細(xì)胞參與了SLE的發(fā)病過程，SLE患者機(jī)體存在外周血CD3+CD56+NKT細(xì)胞數(shù)量及占比降低，且活動(dòng)期其表達(dá)水平更低，與王錫攜[16]報(bào)道結(jié)果一致。NKT細(xì)胞廣泛分布在胸腺、骨髓及肝臟等多個(gè)組織器官中，在外周血中的水平較低，其可同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞的表明標(biāo)志(CD3、T細(xì)胞受體等)和NK細(xì)胞的表明標(biāo)志(CD16、CD56等)，兼有T細(xì)胞與NK細(xì)胞的生物功能，并可連接固有免疫與適應(yīng)性免疫，參與機(jī)體免疫應(yīng)答過程，調(diào)節(jié)自身防御網(wǎng)絡(luò)[17-19]。鄒原方等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者存在CD3+CD56+NKT細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞功能缺陷，并認(rèn)為其原因可能與機(jī)體分泌干擾素誘導(dǎo)NKT細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究分析認(rèn)為，SLE活動(dòng)期患者機(jī)體存在的大量抗體與免疫復(fù)合物可能誘導(dǎo)NK細(xì)胞減少和NK細(xì)胞功能抑制，導(dǎo)致SLE患者適應(yīng)性免疫與固有免疫調(diào)節(jié)失衡，造成機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂；同時(shí)，CD3+CD56+NKT細(xì)胞可能在殺傷靶細(xì)胞作用時(shí)與其功能凋亡，在SLE進(jìn)展過程中，CD3+CD56+NKT細(xì)胞數(shù)量較少，SLEDAI增加，病情越重，免疫紊亂程度愈加嚴(yán)重。值得注意的是， SLE活動(dòng)期24 h尿蛋白定量高于非活動(dòng)期，CD3+CD56+NKT細(xì)胞與SLE患者24 hUPQ呈負(fù)相關(guān)，表明SLE活動(dòng)期腎功能損害更嚴(yán)重，CD3+CD56+NKT細(xì)胞可能成為SLE早期腎損傷的診斷標(biāo)志物，有待進(jìn)一步探討。

Th1 /Th2細(xì)胞平衡向Th2細(xì)胞漂移是SLE發(fā)病重要病理機(jī)制[22]，在NKT細(xì)胞發(fā)揮免疫過程中可分泌IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞功能增強(qiáng)，使SLE活動(dòng)度增加[23]。并有研究證實(shí)[24-25]，CD3+CD56+NKT細(xì)胞可通過分泌IL-2、IL-6、IL-10等相關(guān)因子參與Th0轉(zhuǎn)化為Th1/Th2細(xì)胞的過程。本次研究中測(cè)定的外周血IFN-γ、IL-4，其分別由Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞分泌，SLE活動(dòng)期IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明顯低于非活動(dòng)期組，而IL-4明顯高于非活動(dòng)期組，且Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CD3+CD56+NKT細(xì)胞與SLE患者IL-4均呈顯著負(fù)相關(guān)，而與IFN-γ無顯著相關(guān)性，提示CD3+CD56+NKT細(xì)胞可能參與了Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)。原因分析，CD3+CD56+NKT細(xì)胞受刺激活化后，通過分泌IL-4等細(xì)胞因子，引發(fā)Th2型免疫反應(yīng)，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)并釋放特異性細(xì)胞因子的功能，抑制T細(xì)胞成熟和分化，導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制破壞，自身反應(yīng)細(xì)胞過表達(dá)，出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)損傷，加重病情。

4 結(jié)論

CD3+CD56+NKT細(xì)胞參與了SLE免疫調(diào)節(jié)過程，其水平與患者SLEDAI評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，CD3+CD56+NKT細(xì)胞可能通過分泌Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子發(fā)揮SLE免疫調(diào)節(jié)作用，值得臨床借鑒。