系統性紅斑狼瘡患者外周血CD3+CD56+NKT水平與Th1/Th2細胞表達的相關性*

高娟 邢燕 張利軍

(1.重慶市九龍坡區中醫院檢驗科，重慶 400016；2.重慶醫科大學附屬第一醫院輸血科，重慶 400016；3.重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科，重慶 400010)

系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)為常見慢性自身免疫性疾病，其發病機制復雜，迄今仍未完全明確。較多學者認為免疫功能紊亂貫穿于SLE的病理過程[1-2]。自然殺傷T(NKT)細胞為異質性T淋巴細胞，同時具有NK細胞與T淋巴細胞的部分特性[3]。CD3+CD56+淋巴細胞為NKT細胞中的一員，其參與了類風濕性關節炎[4]、Graves病[5]等自身免疫性疾病的發病與進展，而在SLE中的研究報道較少，且在SLE中的作用存在較大爭議。本研究選取112例SLE患者，采用流式細胞儀測定CD3+CD56+NKT細胞的表達情況，旨在探討外周血CD3+CD56+NKT細胞表達與相關機制的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月～2020年12月重慶市九龍坡區中醫院收治的112例SLE患者為SLE組。納入標準：①符合美國風濕病學會制定的SLE診斷標準[6]。②近半年內未接受過免疫抑制劑、類固醇激素治療。③未合并其它自身免疫系統疾病。④自愿參與本研究且對研究內容充分知情。排除標準：①合并急慢性感染、嚴重肝腎功能不全及惡性腫瘤者。②非SLE所致精神病。③妊娠期和哺乳期婦女。另選取同期我院體檢科健康自愿者50例為健康組。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 流式細胞儀(美國BD公司，FACScalibur型)，酶標儀(美國BIO-RAD公司，3550UV型)，小鼠抗人單克隆抗體CD3FITC、CD56-PE均由美國BD公司生產，二抗均購自美天旎生物科技公司，IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10酶聯免疫法(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司，淋巴細胞分離液由加拿大Norgen Biotek生產，乙二胺四乙酸(EDTA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)緩沖液由北京索萊寶科技有限公司生產，試驗操作均按試劑說明書執行。

1.2.2 外周血CD3+CD56+NKT測定 采集受試者空腹靜脈血3 mL，EDTA抗凝，取5μL加入流式管，加入單抗CD3FITC、CD56-PE，室溫避光孵育 20 min，再經PBS緩沖液洗滌2次，1200 r/min 離心(離心半徑：10 cm)10 min后收集細胞，上流式細胞儀檢測，使用 Cellquest 軟件獲取并進行數據分析。

1.2.3 外周血相關細胞因子測定 取上述血液2 mL，2000 r/min離心(離心半徑：10 cm)10 min后取血清層，采用酶聯免疫法測定血清中IFN-γ、IL-4濃度，并在酶標儀450 nm處測定吸光度值，通過繪制標準曲線計算出相應指標的濃度。

1.2.4 資料收集 收集患者SLE疾病活動指數(SLEDAI)評分、24 h尿蛋白定量(24 hUPQ)等其他臨床參數。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 SLE組：男34例，女78例；年齡21～63歲，平均(28.41±6.37)歲；體質量指數21～25 kg/m2，平均(23.05±3.28)kg/m2；病程0.5～15年，平均(5.37±1.20)年，按SLEDAI[7]評分分為非活動期(SLEDAI<5分)72例，活動期(SLEDAI≥5分)40例。健康組：男16例，女34例；年齡20～62歲，平均(28.26±6.51)歲；體質量指數21～24 kg/m2，平均(23.12±3.31)kg/m2。兩組受試對象上述臨床資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 兩組CD3+CD56+NKT細胞水平比較 SLE組外周血CD3+CD56+NKT細胞計數及占比均較健康組明顯減小，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 健康組與SLE組外周血CD3+CD56+NKT細胞水平比較

2.3 SLE不同疾病活動度CD3+CD56+NKT細胞水平及其他參數比較 SLE活動期組CD3+CD56+NKT細胞水平及其占比、IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明顯低于非活動期組(P<0.05)，而SLEDAI評分、24 hUPQ、IL-4明顯高于非活動期組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同疾病活動度SLE患者CD3+CD56+NKT細胞水平及其他參數比較

2.4 CD3+CD56+NKT與SLE臨床參數的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，CD3+CD56+NKT細胞與SLE患者SLEDAI評分、24hUPQ及IL-4呈負相關(r=-0.573、-0.682、-0.374，P<0.05)，而與IFN-γ無顯著相關性(r=0.016，P>0.05)，見表3。

表3 CD3+CD56+NKT與SLE臨床參數的相關性分析

3 討論

SLE是一種好發于青壯年的自身免疫性疾病，我國SLE年新發約70～100/10萬例，呈逐年增長趨勢，其中女性患病率約為男性的10倍[8-10]。免疫系統紊亂為SLE的重要病理機制，病情未得到控制常累及血液、關節、皮膚等多器官系統，嚴重危害機體健康。目前SLE的診斷主要依據臨床癥狀、自身抗體指標、免疫學指標及影像學檢查等，但易與類風濕關節炎、系統性血管炎等病癥混淆，造成漏診或誤診[11-13]。隨著近年來對SLE免疫機制研究的不斷深入，學者發現NKT細胞與SLE的發病關系密切，有望成為SLE診斷和病情嚴重程度評估的新指標[14-15]。

本研究結果顯示，SLE組外周血CD3+CD56+NKT細胞計數及占比均明顯小于健康組，且SLE活動期CD3+CD56+NKT細胞水平及其占比明顯低于非活動期組，同時Pearson相關分析發現，CD3+CD56+NKT細胞與SLE患者SLEDAI評分呈顯著負相關，提示CD3+CD56+NKT細胞參與了SLE的發病過程，SLE患者機體存在外周血CD3+CD56+NKT細胞數量及占比降低，且活動期其表達水平更低，與王錫攜[16]報道結果一致。NKT細胞廣泛分布在胸腺、骨髓及肝臟等多個組織器官中，在外周血中的水平較低，其可同時表達T細胞的表明標志(CD3、T細胞受體等)和NK細胞的表明標志(CD16、CD56等)，兼有T細胞與NK細胞的生物功能，并可連接固有免疫與適應性免疫，參與機體免疫應答過程，調節自身防御網絡[17-19]。鄒原方等[20-21]研究發現，SLE患者存在CD3+CD56+NKT細胞數量減少和細胞功能缺陷，并認為其原因可能與機體分泌干擾素誘導NKT細胞凋亡有關。本研究分析認為，SLE活動期患者機體存在的大量抗體與免疫復合物可能誘導NK細胞減少和NK細胞功能抑制，導致SLE患者適應性免疫與固有免疫調節失衡，造成機體免疫系統紊亂；同時，CD3+CD56+NKT細胞可能在殺傷靶細胞作用時與其功能凋亡，在SLE進展過程中，CD3+CD56+NKT細胞數量較少，SLEDAI增加，病情越重，免疫紊亂程度愈加嚴重。值得注意的是， SLE活動期24 h尿蛋白定量高于非活動期，CD3+CD56+NKT細胞與SLE患者24 hUPQ呈負相關，表明SLE活動期腎功能損害更嚴重，CD3+CD56+NKT細胞可能成為SLE早期腎損傷的診斷標志物，有待進一步探討。

Th1 /Th2細胞平衡向Th2細胞漂移是SLE發病重要病理機制[22]，在NKT細胞發揮免疫過程中可分泌IL-4促進Th2細胞功能增強，使SLE活動度增加[23]。并有研究證實[24-25]，CD3+CD56+NKT細胞可通過分泌IL-2、IL-6、IL-10等相關因子參與Th0轉化為Th1/Th2細胞的過程。本次研究中測定的外周血IFN-γ、IL-4，其分別由Th1細胞、Th2細胞分泌，SLE活動期IFN-γ、IFN-γ/IL-4均明顯低于非活動期組，而IL-4明顯高于非活動期組，且Pearson相關分析結果顯示，CD3+CD56+NKT細胞與SLE患者IL-4均呈顯著負相關，而與IFN-γ無顯著相關性，提示CD3+CD56+NKT細胞可能參與了Th1/Th2平衡調節。原因分析，CD3+CD56+NKT細胞受刺激活化后，通過分泌IL-4等細胞因子，引發Th2型免疫反應，Th2細胞功能亢進并釋放特異性細胞因子的功能，抑制T細胞成熟和分化，導致機體免疫調節機制破壞，自身反應細胞過表達，出現自身免疫反應損傷，加重病情。

4 結論

CD3+CD56+NKT細胞參與了SLE免疫調節過程，其水平與患者SLEDAI評分呈顯著負相關，CD3+CD56+NKT細胞可能通過分泌Th1/Th2細胞相關因子發揮SLE免疫調節作用，值得臨床借鑒。