高良姜素通過巨噬細胞極化及抑制鋅指蛋白 Zbed3誘導大鼠肝癌細胞凋亡的研究*

胡春蘭 周龍 田玲 鄧利艷

(1.重慶大學附屬三峽醫院全科醫學科，重慶 500101；2.重慶大學附屬三峽醫院醫學檢驗科，重慶 500101；3.重慶萬州區人民醫院重癥醫學科，重慶 404100)

誘發肝癌產生的因素較多，目前尚未完全掌握，但生活中一些因素會增加肝癌的發病率，如肝炎病毒、進食含有黃曲霉毒素的食物、酗酒等[1]。肝癌早期無特異性特征，隨著病情的發展，患者會產生食欲不振、腹痛腹脹、消瘦等。常見的并發癥為惡心、意識不清、便秘、暈厥、膽固醇水平升高等[2]。尋找安全有效、靶點明確、低毒的天然抗腫瘤藥物是科學界研究的焦點，從中藥中篩選有效的活性物質治療肝癌是中藥發展的中藥渠道。高良姜素是天然的黃酮醇類化合物，可從植物高良姜植株的地上部分及根莖和蜂膠中提取得到。研究發現[3]，高良姜素具有鎮痛、止嘔、抗氧化以及抗腫瘤作用，高良姜素可抑制皮膚癌、骨瘤等癌細胞的增殖、轉移并誘導肺癌細胞凋亡。腫瘤微環境與腫瘤的產生與發展聯系密切，巨噬細胞在腫瘤微環境中較為重要。腫瘤為逃避巨噬細胞的殺傷作用，迫使其極化狀態發生改變，以促進腫瘤發生發展。巨噬細胞極化有兩種類型：M1型(殺傷腫瘤)與M2型(促進腫瘤)?？煽闯?，巨噬細胞極化對腫瘤治療至關重要。涉及巨噬細胞極化的機制也有很多，包括信號轉導通路等。Wnt信號通路的異常與癌細胞生物學行為密切相關，該通路主要由Axin、GSK3β、β-catenin等組成，目前已有多項研究表明該通路中的相關因子(Axin、β-catenin等)在肝癌的轉移、凋亡中具有重要作用[4]。但影響該通路中因子活性的因素較為復雜，目前尚未完全明確。近年來，相關報道表明[5]，Zbed3(鋅指蛋白3)可與wnt號通路中的Axin結合，通過抑制Axin-GSK3β復合體功能，阻滯β-catenin降解，激活Wnt/β-catenin通路，促進細胞增殖。目前，關于Zbed3對人類腫瘤的相關文獻較少，因此本研究探討高良姜素誘導巨噬細胞極化對肝癌大鼠瘤體體積及鋅指蛋白Zbed3的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株 健康SD雄性大鼠74只，鼠齡6～8周，體質量250～300 g，常規飼養，自由飲食飲水，購自杭州固拓生物公司。合格證號：SCXK(浙)2019-0024。Walker-256瘤株購自無錫欣潤生物公司。本研究經重慶大學附屬三峽醫院倫理委員會審批(批號：Y2018-009-12)。

1.2 藥品及配制 高良姜素購自上海莼試生物公司，在使用時將高良姜素溶解于含5%吐溫80的生理鹽水中，并稀釋成實驗所需濃度。

1.3 實驗試劑 Zbed3一抗(上海谷研公司)；GSK3β、Axin一抗(武漢菲恩公司)；β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(貴州平生公司)；辣根過氧化物酶二抗(湖北貓爾沃公司)；TUNEL工作液(蘇州宇恒公司)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆公司)。

1.4 模型建立及分組 取4只大鼠，將Walker-256瘤株常規復蘇、培養擴增、腹水傳代，將含腫瘤細胞的腹腔液注射到皮下種植幼鼠的腋下或腹股溝皮下，每個注射點用0.3～0.5 mL共注射15處。7 d后處死全部皮下種植鼠，手術切除皮下種植瘤塊，挑選出魚肉狀組織，并切成2 mm3大小若干塊。置于生理鹽水中備用，在2～3 h內移植完。 取56只SD大鼠，麻醉后仰位固定，手術區用75%乙醇消毒。在腹正中皮膚切開5～10 mm用顯微組織鑷子將肝包膜捅一小口，將腫瘤塊沿隧道嵌入。移植完畢后檢查無滲血逐層縫合腹壁[6]。 移植成功1 W后，將未處理的14只健康大鼠作為對照組，常規飼養；56只模型大鼠意外死亡1只，建模失敗3只，剩余52只大鼠隨機分為模型組(模型大鼠常規飼養)、高良姜素低劑量組(模型+25 mg/kg/d高良姜素灌胃)、高良姜素中劑量組(模型+50 mg/kg/d高良姜素灌胃)及高良姜素高劑量組(模型+100 mg/kg/d高良姜素灌胃)，每組13只，各組開始治療時間為移植1周后；治療時間為 28 d，即移植后 35 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 HE染色觀察各組大鼠病理形態 取各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死，取出肝臟組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規制作切片，并進行HE染色，最后以中性樹膠封片，在偏光顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織中的病理改變。

1.5.2 TUNEL檢測肝癌細胞凋亡 取各組大鼠肝癌組織石蠟切片脫蠟，加入20 μg/mL不含核酸內切酶的蛋白酶K，常溫孵育15～30 min，PBS洗滌后加入TUNEL檢測液，常溫無光孵育1 h，PBS清洗，加50 μLconvertr-POD，常溫無光孵育0.5 h。PBS清洗，DAB液顯色，沖洗，蘇木素復染，脫水透明，封片。熒光顯微鏡下觀察，并計數其中發熒光的陽性細胞。凋亡率:凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5.3 各組大鼠瘤體體積檢測 治療結束后，取各組大鼠麻醉后處死，剖腹、暴露肝臟，在手術顯微鏡下用游標卡尺測定腫瘤最大長徑(a)和最短徑(b)。

1.5.4 免疫組化檢測腫瘤巨噬細胞中CD11c(M1型巨噬細胞標志蛋白)、CD206(M2型巨噬細胞標志蛋白)表達 采用免疫組化SP法檢測腫瘤相關巨噬細胞標志物(CD11c、CD206)的表達。制作2 μm厚度的肝癌石蠟組織連續切片，二甲苯脫蠟并在梯度乙醇中進行水化，之后將組織切片置于 EDTA抗原修復溶液中進行高壓抗原修復，將切片在3%過氧化氫中孵育20 min阻斷內源過氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗體CD206、CD11c(1∶100)。然后4℃下孵育過夜， 用PBS溶液沖洗后加入通用型二抗在37℃下孵育30 min。PBS洗片后，進行DAB顯色。終止顯色后，蘇木精復染、梯度乙醇脫水、透明、封片及鏡下觀察。免疫組化結果的判定由兩名臨床經驗豐富的病理科醫師雙盲下完成。隨機選擇切片組織上5個不重復視野進行免疫組化評分，評分包括染色強度和陽性細胞百分比，染色強度定義如下:棕褐色:3分、棕黃色:2分、淡黃色:1分、著色弱或不著色:0分，陽性細胞百分比即染色細胞占視野內全部細胞的百分比評分。定義如下:≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分； >75%為4分。 切片最終評分=著色細胞強度評分×陽性細胞百分比評分。最終評分0分記為陰性；1～3分記為弱陽性；4～6分記為中等強度陽性；400倍鏡下選取5處代表性區域，評估其陽性細胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定義為高表達，小于平均值定義為低表達。

1.5.5 Wbstern Blot檢測Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平 取各組大鼠肝組織，蛋白裂解液裂解，勻漿機勻漿，離心后收集上清。測定蛋白濃度。將組織裂解產物進行電泳，硝酸纖維素膜轉印，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Zbed3、GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(1∶500)，后加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1200)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖象。蛋白含量通過增強化學發光試劑盒檢測并取其與B-actin的比值作為蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 HE染色結果 對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞排列有序，形態正常；模型組大鼠瘤組織呈膨脹性生長，癌細胞大小不一，肝細胞索擠壓，排列不齊，并可見纖維素樣結構；高良姜素低、中、高劑量組大鼠均出現腫瘤細胞間隙增寬，腫瘤細胞出現不同程度的腫脹變性，呈現泡沫狀改變，腫瘤細胞巢可見大量炎細胞浸潤，各組均可見不同程度的腫瘤細胞壞死灶。見圖1。

圖1 HE染色結果(400×)

2.2 肝癌細胞凋亡檢測結果 對照組大鼠無肝癌細胞；模型組細胞凋亡率(21.32±2.14)%低于高良姜素低劑量組(29.45±3.28)%，差異有統計學意義(t=5.085，P<0.05)；高良姜素低劑量組細胞凋亡率低于高良姜素中劑量組(36.41±3.17)%，差異有統計學意義(t=3.737，P<0.05)；高良姜素中劑量組細胞凋亡率低于高良姜素高劑量組(47.25±5.31)%，差異有統計學意義(t=4.294，P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠肝癌細胞凋亡結果(400×)

2.3 各組大鼠瘤體體積檢測結果 對照組大鼠無瘤體，模型組瘤體體積(124.35±13.47)mm3高于高良姜素低劑量組(95.26±8.47)mm3，差異有統計學意義(t=6.841，P<0.001)；高良姜素低劑量組瘤體體積高于高良姜素中劑量組(67.28±5.32)mm3，差異有統計學意義(t=10.470，P<0.001)；高良姜素中劑量組瘤體體積高于高良姜素高劑量組(54.71±5.14)mm3，差異有統計學意義(t=8.838，P<0.001)。見圖3。

圖3 各組大鼠瘤體體積對比

2.4 CD11c、CD206檢測結果 與對照組相比，模型組大鼠肝癌組織中CD11c陽性率降低、CD206升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。見表1、圖4。

表1 各組大鼠CD11c、CD206水平對比

2.5 Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平檢測結果 與對照組相比，模型組大鼠肝組織中GSK3β、Axin水平降低，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。見表2、圖5。

圖4 CD11c、CD206水平對比

表2 各組下列指標水平對比

圖5 各組蛋白水平比較

3 討論

肝癌是我國最常見的腫瘤之一，根據國家癌癥中心發布的數據，2018年預估新發病例近50萬人，死亡人數43萬，發病后死亡比例較高[7]。本研究運用高良姜素治療肝癌大鼠，探討對巨噬細胞極化以及瘤體體積、鋅指蛋白Zbed3的影響。

近年來，炎癥在腫瘤中扮演越來越重要的角色，腫瘤免疫微環境在腫瘤發生發展中的作用成為近些年來腫瘤研究的熱點。巨噬細胞在腫瘤細胞中至關重要，包含兩個表型，M1型巨噬細胞可抑制癌細胞增殖并促進其凋亡、提高機體免疫能力，M2 型可以分泌細胞因子轉化生長因子-β，白介素1β等降低機體的免疫功能促進腫瘤的生長，直接或間接地促進血管生成和腫瘤轉移[8-9]。研究發現在膠質瘤[10]、胰腺癌[11]等惡性腫瘤中，M2型巨噬細胞提示患者預后不良。高良姜素具有鎮痛、抗氧化，抗腫瘤等作用，且已有研究證實其在肝癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]等腫瘤中均可促進細胞凋亡。本文研究發現，在肝癌中，M1型巨噬細胞標志蛋白CD11c表達低于健康大鼠，M2型巨噬細胞標志蛋白CD206表達高于健康大鼠，且呈現出明顯的劑量依賴性。且本文TUNEL檢測結果提示，在經過高良姜素干預后，癌細胞凋亡增加。TUNEL的原理是利用細胞的凋亡使在細胞內外各種誘導凋亡因素的作用下，經一系列胞內信號轉導系統激活內源性核酸內切酶，該酶切開 DNA 而形成 180-200bp 或其整倍數的寡核苷酸片段，暴露出的 3'羥基在末端轉移酶(TDT)的作用下與生物素標記的核苷酸結合，最終借助抗生物素抗體結合的過氧化物酶，使凋亡細胞被特異性地標記和顯示出來。謝昌利等[16]在對肝癌的實驗中提出，M1型巨噬細胞可促進癌細胞的凋亡，在經過干擾IRF1后，促進了M1型巨噬細胞向M2型轉化，促進了癌細胞的增殖。在石旭等[17]對肝癌的實驗中提出，高表達的 hnRNP L可促進M2型巨噬細胞標志蛋白CD206的表達，從而促進肝癌發展。汪俊劍等[18]在對肺癌細胞的研究中提出，高良姜素可通過阻滯細胞周期進程,降低線粒體膜電位,打破細胞內鈣離子穩態來誘導肺癌細胞凋亡。本研究與上述研究結果相似，因此本文推測，高良姜素可能是通過提高CD11c表達，促進巨噬細胞向M1型轉化，通過抑制CD206表達，阻滯巨噬細胞向M2型轉化，從而促進癌細胞凋亡，抑制增殖。且本文中HE染色結果也表明在經過高良姜素干預后腫瘤細胞出現病死灶。

相關研究表明[19]，Zbed3在肺癌中高表達，并與腫瘤淋巴結轉移相關，影響患者的預后，提示其可能是維持肺癌惡性表型的分子，可能成為臨床治療靶點。Wnt信號通路的異常與腫瘤產生、發展密切相關。目前，已有研究證實[20]，Zbed3可通過抑制小鼠胚胎成纖維細胞中的Axin-GSK3β復合體功能，阻滯β-catenin降解，使得Wnt通路激活后促進細胞增殖。另有研究發現[21]，抑制Zbed3水平后，肺癌細胞的增殖、侵襲能力下降，提示其參與腫瘤的預后。在肺癌中，降低Zbed3水平后β-catenin、c-myc、cyclin-D1表達降低，提示可能是癌細胞增殖能力下降的原因。相關研究提出[22]，Zbed3可能為調節Wnt通路中關鍵分子β-catenin及下游靶基因的重要分子，從而影響癌細胞的增殖及侵襲，促進肺癌的惡性表型及患者預后。近年來，多項研究表明，高良姜素通過調控Wnt/β-catenin通路可調控癌細胞的生物學行為[23]。在李永峰等[24]對乳腺癌細胞的研究中提出，高良姜素通過調控Wnt/β-catenin通路，促進乳腺癌細胞凋亡。經本文研究發現，與肝癌大鼠相比，在經過高良姜素干預后，GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低，且呈現出劑量依賴性。范垂鋒[25]在對肺癌的研究中提出，抑制Zbed3表達后，通過促進Axin-GSK313復合體的功能后，降低了β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平，從而抑制了肺癌細胞的增殖并促進了凋亡。劉明江等[26]在研究中提出，通過提高GSK3β水平后可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進巨噬細胞向M1型分化，從而抑制肝癌細胞的增殖并促進凋亡。本文研究結果與上述研究結果相似，因此本文認為，高良姜素可能是通過調控Wnt/β-catenin通路，從而促使了巨噬細胞向M1型轉化，促進癌細胞凋亡，降低了Zbed3的表達。且本文瘤體體積檢測結果也表明在經過高良姜素的治療后，體積減小。

4 結論

高良姜素通過調控Wnt/β-catenin通路，促進巨噬細胞向M1型轉化并抑制其向M2型轉化，降低了Zbed3水平從而促進癌細胞凋亡并減小瘤體體積。