高良姜素通過巨噬細胞極化及抑制鋅指蛋白 Zbed3誘導(dǎo)大鼠肝癌細胞凋亡的研究*

胡春蘭 周龍 田玲 鄧利艷

(1.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，重慶 500101；2.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，重慶 500101；3.重慶萬州區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 404100)

誘發(fā)肝癌產(chǎn)生的因素較多，目前尚未完全掌握，但生活中一些因素會增加肝癌的發(fā)病率，如肝炎病毒、進食含有黃曲霉毒素的食物、酗酒等[1]。肝癌早期無特異性特征，隨著病情的發(fā)展，患者會產(chǎn)生食欲不振、腹痛腹脹、消瘦等。常見的并發(fā)癥為惡心、意識不清、便秘、暈厥、膽固醇水平升高等[2]。尋找安全有效、靶點明確、低毒的天然抗腫瘤藥物是科學(xué)界研究的焦點，從中藥中篩選有效的活性物質(zhì)治療肝癌是中藥發(fā)展的中藥渠道。高良姜素是天然的黃酮醇類化合物，可從植物高良姜植株的地上部分及根莖和蜂膠中提取得到。研究發(fā)現(xiàn)[3]，高良姜素具有鎮(zhèn)痛、止嘔、抗氧化以及抗腫瘤作用，高良姜素可抑制皮膚癌、骨瘤等癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展聯(lián)系密切，巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中較為重要。腫瘤為逃避巨噬細胞的殺傷作用，迫使其極化狀態(tài)發(fā)生改變，以促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。巨噬細胞極化有兩種類型：M1型(殺傷腫瘤)與M2型(促進腫瘤)。可看出，巨噬細胞極化對腫瘤治療至關(guān)重要。涉及巨噬細胞極化的機制也有很多，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。Wnt信號通路的異常與癌細胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，該通路主要由Axin、GSK3β、β-catenin等組成，目前已有多項研究表明該通路中的相關(guān)因子(Axin、β-catenin等)在肝癌的轉(zhuǎn)移、凋亡中具有重要作用[4]。但影響該通路中因子活性的因素較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。近年來，相關(guān)報道表明[5]，Zbed3(鋅指蛋白3)可與wnt號通路中的Axin結(jié)合，通過抑制Axin-GSK3β復(fù)合體功能，阻滯β-catenin降解，激活Wnt/β-catenin通路，促進細胞增殖。目前，關(guān)于Zbed3對人類腫瘤的相關(guān)文獻較少，因此本研究探討高良姜素誘導(dǎo)巨噬細胞極化對肝癌大鼠瘤體體積及鋅指蛋白Zbed3的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株 健康SD雄性大鼠74只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量250～300 g，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，購自杭州固拓生物公司。合格證號：SCXK(浙)2019-0024。Walker-256瘤株購自無錫欣潤生物公司。本研究經(jīng)重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院倫理委員會審批(批號：Y2018-009-12)。

1.2 藥品及配制 高良姜素購自上海莼試生物公司，在使用時將高良姜素溶解于含5%吐溫80的生理鹽水中，并稀釋成實驗所需濃度。

1.3 實驗試劑 Zbed3一抗(上海谷研公司)；GSK3β、Axin一抗(武漢菲恩公司)；β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(貴州平生公司)；辣根過氧化物酶二抗(湖北貓爾沃公司)；TUNEL工作液(蘇州宇恒公司)；戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆公司)。

1.4 模型建立及分組 取4只大鼠，將Walker-256瘤株常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)擴增、腹水傳代，將含腫瘤細胞的腹腔液注射到皮下種植幼鼠的腋下或腹股溝皮下，每個注射點用0.3～0.5 mL共注射15處。7 d后處死全部皮下種植鼠，手術(shù)切除皮下種植瘤塊，挑選出魚肉狀組織，并切成2 mm3大小若干塊。置于生理鹽水中備用，在2～3 h內(nèi)移植完。 取56只SD大鼠，麻醉后仰位固定，手術(shù)區(qū)用75%乙醇消毒。在腹正中皮膚切開5～10 mm用顯微組織鑷子將肝包膜捅一小口，將腫瘤塊沿隧道嵌入。移植完畢后檢查無滲血逐層縫合腹壁[6]。 移植成功1 W后，將未處理的14只健康大鼠作為對照組，常規(guī)飼養(yǎng)；56只模型大鼠意外死亡1只，建模失敗3只，剩余52只大鼠隨機分為模型組(模型大鼠常規(guī)飼養(yǎng))、高良姜素低劑量組(模型+25 mg/kg/d高良姜素灌胃)、高良姜素中劑量組(模型+50 mg/kg/d高良姜素灌胃)及高良姜素高劑量組(模型+100 mg/kg/d高良姜素灌胃)，每組13只，各組開始治療時間為移植1周后；治療時間為 28 d，即移植后 35 d。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 HE染色觀察各組大鼠病理形態(tài) 取各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉后處死，取出肝臟組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制作切片，并進行HE染色，最后以中性樹膠封片，在偏光顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織中的病理改變。

1.5.2 TUNEL檢測肝癌細胞凋亡 取各組大鼠肝癌組織石蠟切片脫蠟，加入20 μg/mL不含核酸內(nèi)切酶的蛋白酶K，常溫孵育15～30 min，PBS洗滌后加入TUNEL檢測液，常溫?zé)o光孵育1 h，PBS清洗，加50 μLconvertr-POD，常溫?zé)o光孵育0.5 h。PBS清洗，DAB液顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。熒光顯微鏡下觀察，并計數(shù)其中發(fā)熒光的陽性細胞。凋亡率:凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.3 各組大鼠瘤體體積檢測 治療結(jié)束后，取各組大鼠麻醉后處死，剖腹、暴露肝臟，在手術(shù)顯微鏡下用游標(biāo)卡尺測定腫瘤最大長徑(a)和最短徑(b)。

1.5.4 免疫組化檢測腫瘤巨噬細胞中CD11c(M1型巨噬細胞標(biāo)志蛋白)、CD206(M2型巨噬細胞標(biāo)志蛋白)表達 采用免疫組化SP法檢測腫瘤相關(guān)巨噬細胞標(biāo)志物(CD11c、CD206)的表達。制作2 μm厚度的肝癌石蠟組織連續(xù)切片，二甲苯脫蠟并在梯度乙醇中進行水化，之后將組織切片置于 EDTA抗原修復(fù)溶液中進行高壓抗原修復(fù)，將切片在3%過氧化氫中孵育20 min阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。孵育一抗，即添加兔抗人多克隆抗體CD206、CD11c(1∶100)。然后4℃下孵育過夜， 用PBS溶液沖洗后加入通用型二抗在37℃下孵育30 min。PBS洗片后，進行DAB顯色。終止顯色后，蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、封片及鏡下觀察。免疫組化結(jié)果的判定由兩名臨床經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師雙盲下完成。隨機選擇切片組織上5個不重復(fù)視野進行免疫組化評分，評分包括染色強度和陽性細胞百分比，染色強度定義如下:棕褐色:3分、棕黃色:2分、淡黃色:1分、著色弱或不著色:0分，陽性細胞百分比即染色細胞占視野內(nèi)全部細胞的百分比評分。定義如下:≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分； >75%為4分。 切片最終評分=著色細胞強度評分×陽性細胞百分比評分。最終評分0分記為陰性；1～3分記為弱陽性；4～6分記為中等強度陽性；400倍鏡下選取5處代表性區(qū)域，評估其陽性細胞百分比，取平均值，最后大于平均值即定義為高表達，小于平均值定義為低表達。

1.5.5 Wbstern Blot檢測Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平 取各組大鼠肝組織，蛋白裂解液裂解，勻漿機勻漿，離心后收集上清。測定蛋白濃度。將組織裂解產(chǎn)物進行電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Zbed3、GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1一抗(1∶500)，后加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1200)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖象。蛋白含量通過增強化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測并取其與B-actin的比值作為蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞排列有序，形態(tài)正常；模型組大鼠瘤組織呈膨脹性生長，癌細胞大小不一，肝細胞索擠壓，排列不齊，并可見纖維素樣結(jié)構(gòu)；高良姜素低、中、高劑量組大鼠均出現(xiàn)腫瘤細胞間隙增寬，腫瘤細胞出現(xiàn)不同程度的腫脹變性，呈現(xiàn)泡沫狀改變，腫瘤細胞巢可見大量炎細胞浸潤，各組均可見不同程度的腫瘤細胞壞死灶。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果(400×)

2.2 肝癌細胞凋亡檢測結(jié)果 對照組大鼠無肝癌細胞；模型組細胞凋亡率(21.32±2.14)%低于高良姜素低劑量組(29.45±3.28)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.085，P<0.05)；高良姜素低劑量組細胞凋亡率低于高良姜素中劑量組(36.41±3.17)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.737，P<0.05)；高良姜素中劑量組細胞凋亡率低于高良姜素高劑量組(47.25±5.31)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.294，P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠肝癌細胞凋亡結(jié)果(400×)

2.3 各組大鼠瘤體體積檢測結(jié)果 對照組大鼠無瘤體，模型組瘤體體積(124.35±13.47)mm3高于高良姜素低劑量組(95.26±8.47)mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.841，P<0.001)；高良姜素低劑量組瘤體體積高于高良姜素中劑量組(67.28±5.32)mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.470，P<0.001)；高良姜素中劑量組瘤體體積高于高良姜素高劑量組(54.71±5.14)mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.838，P<0.001)。見圖3。

圖3 各組大鼠瘤體體積對比

2.4 CD11c、CD206檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠肝癌組織中CD11c陽性率降低、CD206升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組CD11c升高、CD206降低(均P<0.05)。見表1、圖4。

表1 各組大鼠CD11c、CD206水平對比

2.5 Zbed3與Wnt通路中GSK3β、Axin、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平檢測結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠肝組織中GSK3β、Axin水平降低，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平升高(均P<0.05)。與模型組相比，高良姜素低劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素低劑量組相比，高良姜素中劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。與高良姜素中劑量組相比，高良姜素高劑量組GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低(均P<0.05)。見表2、圖5。

圖4 CD11c、CD206水平對比

表2 各組下列指標(biāo)水平對比

圖5 各組蛋白水平比較

3 討論

肝癌是我國最常見的腫瘤之一，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2018年預(yù)估新發(fā)病例近50萬人，死亡人數(shù)43萬，發(fā)病后死亡比例較高[7]。本研究運用高良姜素治療肝癌大鼠，探討對巨噬細胞極化以及瘤體體積、鋅指蛋白Zbed3的影響。

近年來，炎癥在腫瘤中扮演越來越重要的角色，腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為近些年來腫瘤研究的熱點。巨噬細胞在腫瘤細胞中至關(guān)重要，包含兩個表型，M1型巨噬細胞可抑制癌細胞增殖并促進其凋亡、提高機體免疫能力，M2 型可以分泌細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β，白介素1β等降低機體的免疫功能促進腫瘤的生長，直接或間接地促進血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤[10]、胰腺癌[11]等惡性腫瘤中，M2型巨噬細胞提示患者預(yù)后不良。高良姜素具有鎮(zhèn)痛、抗氧化，抗腫瘤等作用，且已有研究證實其在肝癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]等腫瘤中均可促進細胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，M1型巨噬細胞標(biāo)志蛋白CD11c表達低于健康大鼠，M2型巨噬細胞標(biāo)志蛋白CD206表達高于健康大鼠，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。且本文TUNEL檢測結(jié)果提示，在經(jīng)過高良姜素干預(yù)后，癌細胞凋亡增加。TUNEL的原理是利用細胞的凋亡使在細胞內(nèi)外各種誘導(dǎo)凋亡因素的作用下，經(jīng)一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，該酶切開 DNA 而形成 180-200bp 或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段，暴露出的 3'羥基在末端轉(zhuǎn)移酶(TDT)的作用下與生物素標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助抗生物素抗體結(jié)合的過氧化物酶，使凋亡細胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。謝昌利等[16]在對肝癌的實驗中提出，M1型巨噬細胞可促進癌細胞的凋亡，在經(jīng)過干擾IRF1后，促進了M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，促進了癌細胞的增殖。在石旭等[17]對肝癌的實驗中提出，高表達的 hnRNP L可促進M2型巨噬細胞標(biāo)志蛋白CD206的表達，從而促進肝癌發(fā)展。汪俊劍等[18]在對肺癌細胞的研究中提出，高良姜素可通過阻滯細胞周期進程,降低線粒體膜電位,打破細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)來誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似，因此本文推測，高良姜素可能是通過提高CD11c表達，促進巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，通過抑制CD206表達，阻滯巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而促進癌細胞凋亡，抑制增殖。且本文中HE染色結(jié)果也表明在經(jīng)過高良姜素干預(yù)后腫瘤細胞出現(xiàn)病死灶。

相關(guān)研究表明[19]，Zbed3在肺癌中高表達，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，影響患者的預(yù)后，提示其可能是維持肺癌惡性表型的分子，可能成為臨床治療靶點。Wnt信號通路的異常與腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，已有研究證實[20]，Zbed3可通過抑制小鼠胚胎成纖維細胞中的Axin-GSK3β復(fù)合體功能，阻滯β-catenin降解，使得Wnt通路激活后促進細胞增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)[21]，抑制Zbed3水平后，肺癌細胞的增殖、侵襲能力下降，提示其參與腫瘤的預(yù)后。在肺癌中，降低Zbed3水平后β-catenin、c-myc、cyclin-D1表達降低，提示可能是癌細胞增殖能力下降的原因。相關(guān)研究提出[22]，Zbed3可能為調(diào)節(jié)Wnt通路中關(guān)鍵分子β-catenin及下游靶基因的重要分子，從而影響癌細胞的增殖及侵襲，促進肺癌的惡性表型及患者預(yù)后。近年來，多項研究表明，高良姜素通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路可調(diào)控癌細胞的生物學(xué)行為[23]。在李永峰等[24]對乳腺癌細胞的研究中提出，高良姜素通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路，促進乳腺癌細胞凋亡。經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn)，與肝癌大鼠相比，在經(jīng)過高良姜素干預(yù)后，GSK3β、Axin水平升高，Zbed3、β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平降低，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。范垂鋒[25]在對肺癌的研究中提出，抑制Zbed3表達后，通過促進Axin-GSK313復(fù)合體的功能后，降低了β-catenin、c-myc、cyclin-D1水平，從而抑制了肺癌細胞的增殖并促進了凋亡。劉明江等[26]在研究中提出，通過提高GSK3β水平后可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進巨噬細胞向M1型分化，從而抑制肝癌細胞的增殖并促進凋亡。本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，因此本文認為，高良姜素可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路，從而促使了巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，促進癌細胞凋亡，降低了Zbed3的表達。且本文瘤體體積檢測結(jié)果也表明在經(jīng)過高良姜素的治療后，體積減小。

4 結(jié)論

高良姜素通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路，促進巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化并抑制其向M2型轉(zhuǎn)化，降低了Zbed3水平從而促進癌細胞凋亡并減小瘤體體積。