猩紅熱患兒A 族鏈球菌emm基因分型及地域與毒力基因分布相關研究

禹定樂，梁云梅，盧清華，馬耀玲，沈敘莊，王傳清，鄭躍杰，楊永弘,

(1. 深圳市兒童醫院呼吸科，廣東 深圳 518038； 2. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院兒科，北京 100043； 3. 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院急診科，湖北 武漢 430000； 4. 國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所微生物研究室，北京 100045； 5. 上海復旦大學附屬兒童醫院細菌實驗室，上海 201102)

A族鏈球菌(group AStreptococcus, GAS)又稱為釀膿鏈球菌或化膿性鏈球菌，作為一種重要的人類病原體，在世界范圍內廣泛分布，與多種疾病有關，如咽扁桃體炎、敗血癥、壞死性筋膜炎、蜂窩織炎、腦膜炎、鏈球菌感染后腎小球腎炎和風濕性心臟病等多種疾病[1]。上呼吸道黏膜和皮膚上皮是GAS的主要定植區域[2]。我國乙類法定傳染病—猩紅熱即是由GAS引起的5～15歲兒童常見的急性呼吸道傳染病，臨床上以發熱、咽峽炎及皮疹為典型癥狀，嚴重者可引起鏈球菌中毒休克綜合征(STSS)等侵襲性感染，甚至死亡[3-4]。近些年，猩紅熱在世界范圍內卷土重來[5-8]，加之仍無可上市使用的疫苗，已引起國內外學者的關注。而猩紅熱“再現”的原因尚未完全明確，推測與GAS遺傳變異，產生新的感染性更強、致病力更高的GAS菌株或克隆群有關[9]。分型是微生物流行病學研究的重要方法。毒力因子在微生物致病性中起著關鍵作用[10]。超抗原是由GAS合成分泌的細胞外毒力因子蛋白，可誘導多種細胞因子釋放和免疫反應，從而引發嚴重的臨床癥狀[11]。GAS毒力因子分布與其emm基因分型和流行的地域之間存在密切的關系[12-13]，但國內尚未充分重視菌株流行地域對GAS毒力因子和emm基因型分布的影響。本研究分析北京和上海兩地區猩紅熱患兒所攜帶的emm1.0型和emm12.0型GAS菌株超抗原基因分布、emm分型及其流行地域，比較超抗原、emm分型與地域之間的關系，為指導GAS疾病尤其是猩紅熱的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 GAS菌株分離自2007年在北京和上海兩所兒童專科醫院門診就診的猩紅熱患兒咽拭子標本，標本采集后常溫下2 h內送至微生物研究室。本研究納入的猩紅熱患兒均無猩紅熱相關的嚴重并發癥及死亡情況。

1.2 菌株分離與鑒定 咽拭子標本采集后常溫下2 h內送至微生物研究室，微生物研究室收到咽拭子標本后立即接種于含5%脫纖維羊血的胰酶瓊脂(TRYPTIC SOY AGAR, TSA)平皿上，于含5%CO2的恒溫孵育箱中37℃條件下孵育18～24 h。根據TSA血平皿中菌落的形態及β溶血環對標本初篩，應用英國OXOID公司的鏈球菌分群診斷試劑盒進行GAS菌株鑒定。經分離與鑒定后的GAS菌株收集到凍存管中凍存備用。

1.3 DNA提取 按照北京生工生物工程公司DNA提取試劑盒說明書操作。

1.4emm基因分型 采用美國疾病控制與預防中心(CDC)(https://www2a.cdc.gov/ncidod/ biotech/strepblast.asp)的方法，對GAS分離株進行emm分型檢測。將擴增合格的產物送至華大基因進行一代測序。將獲得的5’端可變區序列上傳至CDC數據庫(https://www2.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp)，進行emm基因序列同源性比較，確定emm基因分型。

1.5 種毒力基因檢測 通過聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增11種超抗原(speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、ssa和smeZ)，以及2種既往被誤認為超抗原，目前常常和超抗原一起被研究的毒力因子蛋白—鏈球菌半胱氨酸蛋白酶(streptococcalcysteine proteinase,speB)和有絲分裂因子(mitogenic factor,speF)基因。PCR反應混合物體系(25 μL)包含20 mmol DNA模板1 μL，10 mmol上、下游引物各1 μL(由廣州生工生物技術有限公司合成)，12.5 μL的Taq PCR Mix和9.5 μL雙蒸水。擴增反應：94℃預變性1 min，94℃變性1 min，退火30 s(溫度為每個引物相應的退火溫度)，72℃延伸30 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min。毒力因子基因的引物序列參照文獻報道[14]。取PCR擴增后產物5 μL，并在含有GoldView核酸染色劑(購自廣州生工生物技術有限公司)的1.5%瓊脂糖凝膠上，0.5×TAE緩沖液中，120 V條件下進行電泳分離30 min，然后進行可視化和圖像采集。

1.6 統計學處理 應用SPSS 22.0軟件對數據進行Mann-Whitney U test統計分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 對114株GAS菌株進行emm分型，其中emm1.0型 60株，emm12.0型54株；52株分離自北京(emm1.0型31株，emm12.0型21株)，62株分離自上海(emm1.0型29株，emm12.0型33株)。GAS菌株speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、ssa和smeZ超抗原基因攜帶率分別為52.6%、76.3%、80.7%、43.9%、55.3%、57.0%、75.4%、97.4%、93.0%，speB和speF超抗原基因攜帶率均為98.2%，未檢出speL、speM超抗原基因。見表1。

表1 北京和上海地區不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況[株(%)]

2.2 北京、上海地區不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況 北京地區：emm1.0型、emm12.0型GAS菌株4種(speA、speH、speI和speJ)超抗原基因攜帶率各組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，其他毒力基因比較均未見統計學差異(均P>0.05)；上海地區：emm1.0型、emm12.0型GAS菌株5種(speA、speH、speI、speJ和speK)超抗原基因攜帶率各組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，其他毒力基因比較，均未見明顯統計學差異(均P>0.05)。見表2。

表2 北京、上海地區不同emm型GAS菌株超抗原基因攜帶情況比較

2.3emm1.0、emm12.0型GAS菌株不同地區超抗原基因攜帶情況 北京與上海來源的emm1.0型GAS菌株speC、speH、speJ和speK超抗原基因攜帶率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；北京與上海來源的emm12.0型GAS菌株speC、speH、speI、speJ和speK超抗原基因攜帶率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 emm1.0、emm12.0型GAS菌株不同地區超抗原基因攜帶情況比較

3 討論

GAS可引起多種臨床表現，從輕度局部感染到危及生命的侵襲性感染，對公共衛生產生重大影響。GAS感染是兒童患病和死亡的主要原因[15]。2011年在中國香港暴發的猩紅熱事件中，多例患兒出現STSS、敗血癥、咽后壁膿腫等并發癥，且有2例并發STSS患兒死亡[3]。兒童猩紅熱為GAS所致疾病中最常見的病種之一，具有傳染性，易引起暴發流行，且接觸過猩紅熱患者的家庭成員患侵襲性GAS感染的風險增加[4]。在過去的十余年中，猩紅熱在亞洲、歐洲多個國家出現嚴峻的“再現”現象[5-7]，已引起國內外學者的關注。中國GAS的整體流行趨勢和歐美國家一致，2008—2017年中國6 ～ 22歲群體患猩紅熱病例數翻了一番[16]，但在分析中國研究數據時應考慮地域因素，中國幅員遼闊，擁有34個省級行政區，猩紅熱發病率的區域性數據與整體數據之間會略有差異，如2011—2015年上海地區猩紅熱年發病率為7.5～19.4/10萬人口[17]，遠高于2011—2016年全國平均水平(4.1/10萬)[18]。猩紅熱是細菌感染性疾病研究的熱點課題，關注、研究和防控兒童感染GAS導致的猩紅熱成為降低兒童感染性疾病發生、發展及降低兒童死亡率的重點。

GAS作為具有全球重要性的人類特異性細菌病原體，具有多種分型方法，可以分泌多種毒力因子。emm基因分型是目前全世界公認的GAS分型的現代分子方法，是基于對指示M血清型的emm基因進行的序列分析。不同年代及地區流行的GAS有不同的emm型別。本團隊前期研究結果顯示，1993—1994年中國大陸流行的GAS型別依次為M3.1、M1、M4和M12，2005—2006年M12和M1成為最流行型別[19]。本研究數據顯示，雖然emm1型和emm12型是2007年北京和上海兩地區導致兒童猩紅熱的主要GAS菌株克隆群，但北京地區以emm1型位居首位，上海地區則是emm12型。在2011年猩紅熱暴發期間，北京地區流行的首位GAS菌株emm型別卻為emm12型(76.4%)[20]。且自2012年開始，北京地區emm1型GAS菌株數量開始上升，并于2013—2014年超過emm12型，再次成為北京地區首位GAS菌株流行克隆群，直至2018年[21]。自2011年開始，上海地區導致15歲以下兒童發生猩紅熱的emm1型GAS分離株數量呈上升趨勢，在2014年達到頂峰，于2015年趨于下降，但最終沒能超越emm12型成為上海首位流行克隆群[17]。2011—2018年國家疾病預防控制中心整體數據顯示，emm12型是我國猩紅熱流行的主要型別[22-23]。上述數據證實，GAS流行emm型別具有時間和地域的差異性，北京地區GAS菌株的emm型別波動性高于上海地區。

鏈球菌毒力因子在GAS感染的發病機制中起關鍵作用。目前常見的鏈球菌毒力因子包括11種高效促細胞分裂原(speA、C、G、H、I、J、K、L、M、smeZ和ssa)和兩種蛋白質(speB[24]和speF[25])。超抗原基因的分布在不同emm基因分型之間存在很大差異[12, 26]。本研究結果顯示，在emm1.0型和emm12.0型GAS菌株之間，無論是北京地區，還是上海地區，speA、speH、speI和speJ的攜帶率比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。本研究中北京地區GAS菌株的分析結果與2012—2013年[27]及2015—2017年[28]北京地區GAS菌株超抗原的攜帶特點一致，但上海地區GAS菌株的分析結果與同期北京地區GAS菌株超抗原的攜帶特點存在差別，也不同于2012—2016年天津地區GAS菌株超抗原的攜帶特點[29]，GAS菌株獲取年代、地域也可能影響其超抗原基因的分布。

GAS超抗原基因的分布不僅與其克隆流行的地域密切相關，還與疾病種類密切相關[30]。本次猩紅熱單病種(為排除疾病病種因素對結論的影響)兩地區研究結果表明，北京與上海GAS菌株之間，emm1.0型菌株中speC、speH、speJ和speK攜帶率比較差異有統計學意義，但在emm12.0型GAS菌株中，此種差異發生在speC、speH、speI、speJ和speK基因中。在emm1.0與emm12.0型GAS菌株之間，北京地區GAS菌株speA、speH、speI和speJ攜帶率比較差異有統計學意義，而上海地區GAS菌株speA、speH、speI、speJ和speK攜帶率比較則差異無統計學意義，說明不同地理位置GAS毒力基因分布存在差異。

本文不足之處在于，既往研究表明時間遷移可影響GAS毒力因子的分布。本研究未對兩地區GAS菌株進行連續動態監測，未能體現時間對毒力特征的影響。

綜上所述，本研究發現不同地域及emm基因型GAS菌株毒力因子基因分布狀態存在差異，此結論對猩紅熱的防控及疫苗的研制有一定的理論指導意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

致謝：感謝上海復旦大學附屬兒童醫院王藝教授對本研究所作出的貢獻。