環境物體表面不同采樣與接種方法在不同材料表面采樣結果比較

高 園，劉 婷，張衛東，劉 莉，史 揚，劉思娣，付陳超

(1. 中南大學湘雅醫院醫院感染控制中心，湖南 長沙 410008； 2. 德州市婦幼保健院醫院感染管理科，山東 德州 253015； 3. 南昌大學第一附屬醫院感染控制處，江西 南昌 330006； 4. 六安市中醫院醫院感染管理辦公室，安徽 六安 237000； 5. 楚雄彝族自治州婦幼保健院感控科，云南 楚雄 675000)

醫療機構中污染的環境物體表面和醫務人員手是致病菌傳播的重要媒介，也是多重耐藥菌傳播、醫院感染暴發的重要誘因及隱患[1-2]。對醫療機構物體表面和醫務人員手等進行的衛生學評價中，細菌污染監測是常規監測項目，采樣方法的優劣直接影響到檢測結果。目前，最準確的評價方法是細菌定量檢測即活菌計數法，為了有效評價環境表面污染程度，采用既靈敏又有效的采樣方法至關重要。

傳統的環境物體表面菌落總數采樣方法為棉拭子涂抹法[3]。近年來，新的醫院感染監測方法不斷出現[4-5]，為了選擇更合適的環境物體表面監測方法，2020年11月1—30日我們對三磷酸腺苷(ATP)生物熒光法、棉拭子涂抹法、載體壓印法及濾膜法4種采樣方法進行對比研究，為不同物體表面選擇方法簡便、結果可靠、價格較低的環境物體表面監測方法提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SystemSURE Plus型手持式ATP生物熒光檢測儀及配套的試劑與采樣拭子，PT/SFM-3C型全自動抽濾機(孔徑0.45 μm)、一次性使用無菌拭子、一次性使用無菌規格板由重慶龐通醫療器械有限公司生產提供，梅里埃Densichek plus電子比濁儀，普通營養瓊脂培養基及培養器材，一次性無菌接種環，滅菌不銹鋼板，滅菌無紡布，滅菌無塵吸水紙，試驗目標細菌為腐生葡萄球菌標準菌株ATCC 49453。

1.2 研究方法

1.2.1 表面染菌 制作菌懸液：按照《全國臨床檢驗操作規程(第3版)》操作，將腐生葡萄球菌標準菌株(ATCC 49453)接種到血瓊脂平板，質譜鑒定驗證無雜菌污染，將目標菌株增菌培養，用電子比濁儀制備成0.5麥氏單位的菌懸液(1.5×108CFU/mL)，用生理鹽水分別稀釋成含菌量為105、106、107CFU/mL菌懸液。滅菌不銹鋼板染菌：將滅菌無塵吸水紙浸于不同濃度菌液中，確保完全浸濕，取出后稍擰干，在滅菌不銹鋼板表面均勻涂抹，確保不銹鋼板表面染菌均勻，將鋼板置于超凈工作臺內干燥。滅菌無紡布染菌：將滅菌后無紡布浸于不同濃度菌液中，確保充分浸濕，取出后擰干，置于超凈工作臺內干燥。

1.2.2 采樣方法 將滅菌不銹鋼板、無紡布染菌后，在同一不銹鋼板、無紡布表面同時用棉拭子涂抹法、濾膜法、載體壓印法及ATP生物熒光法進行采樣，確保檢測結果的可比性。棉拭子涂抹法：用5 cm×5 cm一次性使用無菌規格板放在被檢物體表面，用浸有生理鹽水的棉拭子1支，在規格板內橫豎往返各涂抹5次，并隨之轉動棉拭子，連續采樣2個規格板面積，采樣面積為50 cm2，將采樣的棉拭頭以無菌方式剪入含5 mL生理鹽水的試管內待檢。載體壓印法：打開平皿蓋，將瓊脂平板反扣于物體表面，勿再移動，按壓10 s采樣，力度以3～5 N為宜，確保將瓊脂與采樣表面充分接觸，然后蓋上平皿蓋，每個載片采樣面積為25 cm2，連續采集2個載片，采樣面積為50 cm2，采樣后送細菌培養。ATP生物熒光法：檢測儀器為System SURE Plus手持式ATP熒光檢測儀及其拭子，使用ATP熒光儀專用無菌棉拭子沾濕含熒光素酶的采樣液(為儀器配套專用)，將5 cm×5 cm一次性使用無菌規格板放在被檢物體表面，在規格板內橫豎往返各涂抹5次，并隨之轉動棉拭子進行采樣，連續采集2個載片，采樣面積為50 cm2。采樣后將采樣棒在管內折斷，然后震蕩使熒光素酶液充分浸濕棒頭，將檢測管插入手持式ATP生物熒光檢測儀進行檢測，15 s內讀取數據，結果以相對發光單位值(RLU)表示。每組試驗重復10次，樣本量均為10。

1.3 培養及檢測方法 棉拭子涂抹法：將采樣液用漩渦振蕩器充分振蕩，取0.5 mL接種于普通營養瓊脂平皿(Φ9 cm)，于(36±1)℃培養48 h后菌落計數。菌落總數(CFU/cm2)= 平板菌落數×稀釋倍數/采樣面積，計算總菌落數。濾膜法：將涂抹法用后剩余采樣液在無菌條件下采用濾膜(0.45 μm)過濾濃縮，將濾膜貼在普通營養瓊脂平皿(Φ9 cm)上，置(36±1)℃溫箱培養48 h后菌落計數。當濾膜上的菌落可計數時：菌落總數(CFU/cm2)=(平皿菌落數+濾膜上菌落數)/采樣面積；當濾膜上的菌落不可計數時，菌落總數(CFU/cm2)=平皿菌落數×稀釋倍數/采樣面積。載體壓印法：采樣完成后，將平皿置于(36±1)℃培養48 h進行活菌計數，計算采樣細菌總數(CFU/cm2)。ATP生物熒光法：采樣后將采樣棒置于檢測儀器中，讀取RLU數值。

1.4 結果評價 比較棉拭子涂抹法、載體壓印法、濾膜法的細菌總數；比較4種采樣方法的合格率(%)，物體表面細菌菌落總數≤10 CFU/cm2為合格，ATP熒光法檢測的RLU值<30為合格；將常規細菌定量檢測法的細菌總數和 ATP 熒光法檢測的RLU數值的相關性進行分析。

2 結果

2.1 物體表面不同染菌濃度下菌落計數比較 試驗結果顯示，不同污染濃度下，不銹鋼板和無紡布均是載體壓印法檢出菌落數最高，其次為濾膜法，棉拭子涂抹法檢出菌落數最低。染菌濃度為105CFU/mL時，對不銹鋼表面采樣，載體壓印法菌落總數高于濾膜法和棉拭子涂抹法，差異有統計學意義(P<0.05)；對無紡布表面采樣，載體壓印法檢出菌落總數高于棉拭子涂抹法(P<0.05)。染菌濃度為106CFU/mL時，對不銹鋼板表面采樣，三者菌落檢出數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對無紡布表面進行采樣，載體壓印法檢出菌落總數高于濾膜法和棉拭子涂抹法(P<0.05)。染菌濃度為107CFU/mL時，對不銹鋼表面和無紡布表面采樣均只有棉拭子涂抹法可以進行菌落計數，濾膜法與載體壓印法均無法計數。見表1。

表1 不同采樣方法檢測不同濃度染菌物體表面的菌落總數比較

2.2 4種采樣方法檢測物體表面合格率比較 對不銹鋼板采樣，染菌濃度為105CFU/mL時，4種采樣方法檢測的合格率均為100%；染菌濃度為106CFU/mL時，4種采樣方法檢測的合格率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；染菌濃度為107CFU/mL時，ATP生物熒光法出現假陰性結果。對無紡布表面采樣，染菌濃度為105CFU/mL時，4種采樣方法檢測的合格率均為100%；染菌濃度為107CFU/mL時，4種采樣方法檢測的合格率均為0；染菌濃度為106CFU/mL時，棉拭子涂抹法、濾膜法、ATP生物熒光法檢測合格率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，載體壓印法合格率低于濾膜法、棉拭子涂抹法和ATP生物熒光法，差異有統計學意義(P<0.05)，載體壓印法檢測合格率最低，ATP生物熒光法檢測合格率最高，載體壓印法較其他方法更靈敏。見表2。

表2 4種采樣方法檢測不同染菌濃度物體表面的合格率比較

2.3 相關性分析結果 將不同采樣方法檢測的細菌總數和ATP熒光法檢測的 RLU數值進行相關性分析。分析結果表明，在染菌濃度為107CFU/mL時，棉拭子涂抹法與ATP生物熒光法對無紡布表面采樣檢測結果的Pearson相關系數為0.838(P=0.002)，兩種采樣方法的檢測結果具有良好的相關性。見圖1。

3 討論

根據中華人民共和國藥典微生物限度檢測[6]，常用的細菌接種方法為傾注法、涂抹法以及濾膜法。傳統棉拭子涂抹法操作繁瑣，步驟較多，檢測周期長，讀取培養結果進行菌落計數的方法不夠直觀精細。ATP生物熒光檢測儀利用“熒光素酶—熒光素體系”快速檢測ATP，利用ATP含量的多少推斷出菌落總數含量，具有快速、高效、靈敏度高等特點，越來越受到國內外醫療機構的關注[7]。近年來，載體壓印法也受到越來越多監督人員的青睞，載體壓印法是將含有營養瓊脂的培養基直接按壓于采樣物體表面，按壓數秒即完成采樣[8]，簡單方便易于操作，取樣后可直接培養，平板自帶格子線方便菌落計數，大大縮短檢測時間。濾膜法最早由Taylor等[9]提出，采用濾膜過濾器將樣品中細菌截留在濾膜上，然后將濾膜貼于培養基上進行培養，檢測結果較平皿法更準確、可靠，適用于低濃度液體標本的培養，能提高細菌檢出率。

本研究對4種采樣方法進行比較，結果顯示，不同污染濃度下，不銹鋼板和無紡布均是載體壓印法檢出菌落數最高，其次為濾膜法，棉拭子涂抹法菌落數檢出最低。與Claro等[10]報道的平皿接觸在棉墊、聚丙烯和不銹鋼制品表面采集艱難梭菌的采樣率明顯高于植絨尼龍拭子和普通棉拭子的檢出率結果相符。當不銹鋼板染菌量適中時，棉拭子涂抹法和載體壓印法的菌落檢出數基本一致，與李曄等[11]的研究結果相似。當無紡布染菌量適中時，載體壓印法對腐生葡萄球菌的細菌檢測靈敏度高于棉拭子涂抹法、濾膜法及ATP生物熒光法，與Obee 等[12]的研究結果一致。載體壓印法使用方便，采樣和培養方法較棉拭子涂抹法和濾膜法簡單，菌落檢出數及靈敏度高于其他采樣方法，因此可以用于醫療機構環境物體表面和手表面的快速監測。但是載體壓印法所用載片采樣面積相對較小，會出現漏檢現象，因此，在實際監測過程中可以適當增加采樣數量以提高檢出率。但是，當采樣表面不平整時應使用棉拭子涂抹法代替載體壓印法。

利用ATP生物熒光法快速檢測物體表面菌落數時容易出現假陰性結果。說明 ATP生物熒光檢測法需要一定的樣本濃度，樣本量過低會影響檢測的準確性[13]。邢書霞等[14-15]研究中證明ATP生物熒光法與傳統細菌平板培養法對清潔物品微生物污染的檢測具有良好的相關性。本文研究結果發現染菌濃度為107CFU /mL時ATP生物熒光法與棉拭子涂抹法對人工污染的無紡布表面檢測結果具有良好的相關性，但由于ATP生物熒光法檢測靈敏度低，檢測結果與采樣方式、監測環境等有關，因此，在實際應用中還有一定的挑戰。本研究的局限性在于無法保證不同不銹鋼板或無紡布表面染菌濃度完全相同，因此，不同批次之間檢測結果會有差異。

醫院的工作環境是醫務人員需要經常接觸的地方，由于無自凈能力，極易受到病原微生物的污染，對患者健康構成重大威脅[16]。醫院微生物學檢測工作者應對細菌的種類、數量進行及時、準確的檢測，并及時將檢測結果反饋至臨床，可以更好的指導臨床做好消毒滅菌工作，從而減少醫院感染的發生。