外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平預測早期卵巢癌患者腹腔鏡術后淋巴結轉移分析*

曾海榮，黃 丹，張建軍，華海琴

儋州市人民醫院：1.健康體檢部；2.檢驗科；3.腫瘤科，海南儋州 571700

手術是治療早期卵巢癌(OC)患者重要手段，可有效切除病灶，降低腫瘤負荷，提高患者生存時間[1]。腹腔鏡手術因具有無創、恢復快等優勢被廣泛用于OC手術中，成為開腹手術外，治療早期OC的有效術式[2]。盡管早期OC患者經腹腔鏡手術治療后生存時間得以延長，但術后淋巴結轉移風險仍較高，增加病死風險，導致不良預后[3-4]。因此，尋求可早期預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險新型指標十分必要。研究發現，OC發生、發展不僅與細胞增殖及侵襲等有關，還與患者免疫調節功能失調存在密切聯系[5]。淋巴細胞亞群在維持機體免疫平衡中具有重要作用，CD8+T淋巴細胞是細胞毒性T淋巴細胞，主要功能是直接殺傷靶細胞，對輔助T淋巴細胞及B淋巴細胞免疫調節具有抑制作用，進而抑制細胞免疫形成[6]。自然殺傷細胞(NK)是機體重要免疫細胞，與抗腫瘤、免疫調節等有關，可識別靶細胞、殺傷介質[7]。結合NK、CD8+T淋巴細胞機制及免疫與OC關系，推測NK、CD8+T淋巴細胞可能與早期OC患者發展有關，目前關于NK、CD8+T淋巴細胞與早期OC患者術后淋巴結轉移關系的具體結論尚未證實，本研究主要觀察外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞在早期OC患者中表達，并分析二者對預測早期OC患者腹腔鏡手術后淋巴結轉移的價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2016年3月至2018年3月本院收治完成腹腔鏡手術后3年內發生淋巴結轉移的40例早期OC患者病歷資料，設為轉移組；另收集同期本院收治完成手術后3年內未發生淋巴結轉移的40例早期OC患者資料，設為未轉移組；兩組患者年齡、疾病類型、合并基礎疾病等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。見表1。

1.2入選標準

1.2.1納入標準 (1)OC符合《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南(第四版)》[8]中診斷標準，且經體格檢查、實驗室檢查、病理組織學檢查等確診；(2)均為早期OC，無明顯癥狀，患者臨床分期[9]為Ⅰ期(腫瘤局限于卵巢)或Ⅱ期(一側或雙側卵巢腫瘤，伴盆腔內擴散)；(3)患者均在本院完成腹腔鏡手術治療，且術后獲得隨訪結果，隨訪時間為3年；(4)患者臨床資料完整，資料中包含本次研究所需基線資料及重要實驗室指標，如外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平；(5)均為初次診斷，未進行放化療治療。

1.2.2排除標準 (1)合并乳腺癌、宮頸癌等其他惡性腫瘤者；(2)合并腎衰竭、肝炎等重要臟器疾病者；(3)伴凝血功能障礙者；(4)確診時即存在淋巴結轉移患者；(5)隨訪期間病死、復發患者，或因各種原因未完成隨訪者。

1.3方法

1.3.1隨訪 全部患者腹腔鏡手術后均在本院接受定期隨訪，隨訪方式主要以電話及門診為主，術后第1～2年，每2～3個月到院復查，第3年，每4～6個月到院復查，內容包括詢問患者癥狀，檢測腫瘤標志物等，觀察患者淋巴結轉移情況。

1.3.2資料中早期OC患者術后淋巴結轉移評估及分組方法 查閱患者資料，記錄淋巴結轉移情況，查閱資料過程中，將發生淋巴結轉移者納入轉移組，反之為未轉移組；判斷方式如下[10]：使用Voluson E8陰道超聲檢查儀(美國GE)進行檢查，探頭頻率5～9 MHz，指導患者排空膀胱，取膀胱截石位，利用已消毒的避孕套護住探頭，緩慢進入陰道3～4 cm，觀察卵巢大小、外形及內部回聲等情況，觀察淋巴結轉移情況，一旦發現與圓形結節相似，單個淋巴結最小直徑≥1.0 cm可判斷淋巴結轉移，并結合病理學檢查確診。

1.3.3主要實驗室指標搜集方法 收集本次研究所需的實驗室相關指標數據，主要包括糖類抗原125(CA125)、人附睪蛋白-4(HE4)等常規腫瘤標志物及主要研究指標外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平；檢測簡要方法如下：于患者入院時，采集清晨空腹外周靜脈血6 mL，其中3 mL血液以3 000 r/min速率離心10 min(TD5Z型離心機，廠家：美國貝克曼公司)，離心半徑10 cm，取血清，置于冰凍環境下保存待檢；分別采用酶聯免疫吸附法、化學發光法測定血清HE4、CA125水平；試劑盒由美國R&D公司提供；操作遵照試劑盒說明書進行；剩余3 mL血液采用FACScalibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測外周血NK細胞數量及CD8+T淋巴細胞水平。

1.3.4基線資料搜集方法及內容 查閱資料，設計一般資料填寫表，采集并記錄患者相關資料，主要包括年齡、疾病類型(上皮性癌/惡性生殖細胞腫瘤/其他)、臨床分期(Ⅰ期/Ⅱ期)、合并基礎疾病[包括高血壓(收縮壓≥140 mm Hg或舒張壓≥90 mm Hg)、糖尿病(空腹血糖≥7 mmol/L，或葡萄糖負荷試驗2 h血糖≥11.0 mmol/L)等]等。

2 結 果

2.1兩組患者基線資料、主要實驗室指標比較 轉移組患者入院時血清CA125、HE4水平、外周血CD8+T淋巴細胞水平高于未轉移組，外周血NK細胞水平低于未轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組患者其他基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各指標與早期OC患者術后淋巴結轉移關系的回歸分析結果 將2.1中比較有差異的變量納入作為自變量(均為連續變量)，將早期OC患者術后淋巴結轉移狀況作為因變量(1=轉移，0=未轉移)，經二元Logistic回歸分析后，將全部自變量納入建立多元回歸模型，結果顯示，入院時HE4、CD8+T淋巴細胞高水平、NK細胞低水平均可能與患者術后淋巴結轉移有關，可能作為淋巴結轉移發生的風險因子(P<0.05)。見表2。

表2 各指標與早期OC患者術后淋巴結轉移關系的回歸分析結果

2.3入院時外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞單獨及聯合預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險的價值 將早期OC患者術后淋巴結轉移狀況作為狀態變量(1=轉移，0=未轉移)，將入院時外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平作為檢驗變量，繪制ROC曲線圖，見圖1。結果顯示，入院時NK細胞、CD8+T淋巴細胞單獨及聯合預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險的AUC分別為0.894、0.836、0.930，均有一定預測價值，且當二者cut-off值分別取15.142%、25.208%時，可獲得最佳預測價值。見表3。

表3 入院時外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞單獨及聯合預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險的價值

圖1 入院時外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞單獨及聯合預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險的ROC曲線圖

2.4外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平相關性分析 經一般線性雙變量Spearman直線相關檢驗發現，入院時外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平之間呈負相關(r=-0.446，P<0.001)。散點圖見圖2。

圖2 外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平相關性分析的散點圖

3 討 論

腹腔鏡手術具有微創、腹腔暴露少、術后并發癥風險低等優勢，應用于早期OC患者中，可輔助術者精準切除腫瘤病灶，促進患者術后恢復，提高生存質量[11]。但術后淋巴結轉移仍是OC患者預后不良重要因素。因此，尋求可早期預測OC患者術后淋巴結轉移的指標成為近年研究重難點。

CA125雖被證實為評估OC患者病情及預后的重要腫瘤標志物，但在乳腺癌、結腸癌或良性婦科疾病中表達也會異常升高，特異度較低[12]。本研究中，轉移組患者入院時血清CA125水平高于未轉移組，但經回歸分析發現，CA125高水平并非早期OC術后淋巴結轉移風險因子，這可能與CA125指標穩定性不佳、受其他因素影響有關。HE4是診斷、評估OC的另一常用腫瘤標志物，在正常組織中表達水平較低，在OC患者中血清水平顯著升高[13]。據報道，血清HE4與OC淋巴結轉移及預后有關，且該指標的靈敏度、特異度較CA125高[14]。本研究結果顯示，轉移組患者入院時血清HE4水平高于未轉移組，且經回歸分析發現，HE4高水平與早期OC患者術后淋巴結轉移有關，但其風險系數OR值較CD8+T淋巴細胞水平低，出現這一結果可能與該指標易受年齡、基礎病等因素影響有關。未來仍需尋求其他可能對預測OC患者術后淋巴結轉移風險有一定價值的指標。

近年研究發現，腫瘤發生及發展與機體免疫功能有密切聯系，免疫功能紊亂可能會導致腫瘤進一步發展，不利于預后[15]。T淋巴細胞是免疫反應重要參與者，是評價機體免疫功能重要指標，參與機體抗腫瘤免疫應答。CD8+T淋巴細胞屬于細胞毒性T淋巴細胞，主要功能是殺傷靶細胞，通過自身或抑制因子對免疫功能起負向調節作用，抑制T淋巴及B淋巴細胞免疫調節，抑制細胞免疫及抗體形成。在機體腫瘤發生及發展過程中，可刺激和誘導CD8+T淋巴細胞增值，而CD8+T淋巴細胞增多在一定程度上促進腫瘤細胞生長，增加轉移及復發風險，不利于預后[16]。趙艷勛等[17]研究報道，CD8+T淋巴細胞水平與OC分期呈正相關，可能參與疾病發展。推測外周血CD8+T淋巴細胞水平可能與早期OC腹腔鏡術后淋巴結轉移有關。NK細胞是機體免疫系統重要組成部分，具有免疫清除及免疫監視功能，可分泌多種細胞因子，如干擾素、腫瘤壞死因子等協同其抗腫瘤[18]。據報道，活化的NK細胞可抑制腫瘤生長及轉移，通過擴增NK細胞數量、提高其活性，可增強抗腫瘤效果[19]。推測外周血NK細胞可能與早期OC腹腔鏡術后淋巴結轉移有關。

本研究結果顯示，轉移組患者外周血CD8+T淋巴細胞水平高于未轉移組，外周血NK細胞水平低于未轉移組，且經回歸分析發現，入院時CD8+T淋巴細胞高水平、NK細胞低水平均可能與患者術后淋巴結轉移有關，說明CD8+T淋巴細胞高水平、NK細胞低水平可能與早期OC患者腹腔鏡術后淋巴結轉移存在一定聯系。分析其原因可能為，CD8+T淋巴細胞水平異常升高，加劇患者失調的免疫調控機制，加重免疫損傷，進一步促進疾病進展；此外，CD8+T淋巴細胞高水平抑制宿主免疫反應，降低消除癌細胞能力，導致腫瘤細胞持續生長，增加淋巴結轉移風險[20]。NK細胞低水平可能發揮免疫逃逸作用，促進腫瘤細胞生長、增殖，增加術后淋巴結轉移風險[21]。但NK細胞在OC患者中具體作用機制還需證實。進一步繪制ROC曲線發現，入院時NK細胞、CD8+T淋巴細胞單獨及聯合預測早期OC患者術后淋巴結轉移風險均有一定價值，且當二者cut-off值分別取15.142%、25.208%時，可獲得最佳預測價值，尤其是二者聯合檢測預測價值更高，提示未來臨床可考慮早期監測早期OC患者外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞水平，一旦發現表達異常，應及時采取相關免疫治療措施，降低術后淋巴結轉移風險；NK細胞、CD8+T淋巴細胞可能作為腫瘤免疫治療新靶點。此外，本研究還觀察外周血NK細胞、CD8+T淋巴細胞之間相關性，發現二者呈負相關，提示NK細胞、CD8+T淋巴細胞可能相互作用，共同參與OC發生及發展，但二者具體作用機制尚未明確，具體結論還需進一步證實。

綜上所述，外周血NK細胞低水平、CD8+T淋巴細胞高水平與早期OC患者腹腔鏡術后淋巴結轉移有關，二者對預測患者術后淋巴結轉移風險具有一定價值。