血清miR-671-3p、miR-135b水平與老年乳腺癌患者化療耐藥性的相關性*

余喜梅，張雯捐，龔 燁△

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院:1.乳腺甲狀腺科;2.眼科,新疆烏魯木齊 830001

現階段，化療作為乳腺癌的主要治療手段之一，可有效殺滅腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞的增殖與生長，延緩病情進展，延長患者生存時間，改善預后[1]。但部分乳腺癌患者接受化療后存在化療耐藥情況，降低化療效果，甚至造成化療失敗，增加患者病死風險；特別是老年腫瘤患者，老年患者因機體多系統功能減弱，抵抗能力和耐受能力降低，一旦發(fā)生化療耐藥性，病死風險進一步提高[2]。因此，早期預測老年乳腺癌化療患者是否發(fā)生耐藥對提高化療效果，延長患者生存時間具有重要意義。微小核糖核酸(MicroRNA，miR)主要由18～24個核苷酸組成，可通過下調靶基因的表達或翻譯參與調節(jié)細胞的發(fā)育、增殖等過程中[3]。研究指出，miR與多種癌癥疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，也與癌癥疾病化療耐藥性的產生存在密切關聯[4]。miR-671-3p是miR-671家族的成員之一，已有研究證實，miR-671-3p過表達可明顯抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲遷移能力[5]。miR-135b也是miR的常見類型之一，研究指出，miR-135b在三陰性乳腺癌、胃癌等多種癌性疾病中呈高表達現象，可發(fā)揮促癌基因的作用[6]。由上述miR-671-3p、miR-135b在腫瘤疾病中的作用特點，推測血清miR-671-3p、miR-135b水平可能與老年乳腺癌患者化療耐藥性有關。基于此，本研究將重點分析血清miR-671-3p、miR-135b水平與老年乳腺癌患者化療耐藥性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2020年2月在本院接受化療且化療結束后產生耐藥性的52例老年乳腺癌患者作為耐藥組，另同期選取在本院接受化療且化療結束后未產生耐藥性的52例老年乳腺癌患者作為敏感組，收集兩組病歷資料。納入標準：(1)乳腺癌符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2017年版)》[7]中相關診斷標準，且經乳腺超聲、乳腺鉬靶、穿刺活檢等檢查確診；(2)預計生存時間>6個月；(3)惡性腫瘤國際臨床病期分期(TNM)[8]為ⅡB期、Ⅲ期；(4)全部患者均接受同一種新輔助化療方案，且化療周期一致；(5)患者病歷資料、影像學檢查結果等資料均完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)既往接受手術治療；(3)既往接受放化療；(4)原位癌成分太多難以確認浸潤性癌大小或無法臨床評估療效；(5)化療前白細胞<3×109/L；(6)化療前血小板<80×109/L；(7)伴有遠處轉移。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2方法

1.2.1新輔助化療方法 參照《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2017年版)》中相關內容，為老年乳腺癌患者實施新輔助化療，具體內容如下：采用FAC新輔助化療方案，環(huán)磷酰胺+多柔比星+氟尿嘧啶。環(huán)磷酰胺(通化茂祥，生產批號20181120，規(guī)格：50 mg×24 s)：第1天，靜脈沖入，500 mg/m2；多柔比星(海正輝瑞制藥有限公司，生產批號20180623，規(guī)格為50 mg)：第1天，靜脈沖入，50 mg/m2；氟尿嘧啶(通化茂祥，國藥準字H22023469，規(guī)格為10 mL：0.25 g)：第1、8天，靜脈滴注，600 mg/m2。21 d為1個周期，共化療6個周期。

1.2.2化療耐藥性檢測方法 化療結束1 d時，在超聲引導下，患者接受穿刺活檢，取0.5～1.0 mm的新鮮腫瘤組織，使用組織消化酶進行消化，消化后使用篩網過濾，最后使用湖南邁克爾實驗儀器有限公司的KC-42B低速離心機進行離心處理，以3 000 r/min的離心速度離心10 min，離心完畢后取細胞懸液，并將其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中，制備細胞混懸液。在冰浴環(huán)境下，制備細胞-膠原蛋白混合液，接種在24孔的細胞培養(yǎng)板內。24 h后，加入血漿藥物濃度的環(huán)磷酰胺，靜置24 h。試驗過程中涉及無藥藥物的空白組。結果判定標準：采用含藥組的細胞數量/空白組數目的百分比評估藥物敏感性，若<50%則判定為化療敏感，≥50%則為化療耐藥，分別納入耐藥組和敏感組。

1.2.3基線資料調查方法 自制基線資料調查問卷，詳細詢問患者及其家屬并記錄患者一般情況，內容包括：(1)年齡；(2)腫瘤最大徑；(3)TNM分期：劃分為ⅡB期、Ⅲ期；(4)飲酒史：飲酒時間>5年，每次攝入酒精量>10 g；(5)吸煙史：連續(xù)或累計吸煙6個月或以上；(6)體重指數(BMI)：體重正常(BMI<23.9 kg/m2)、肥胖或超重(BMI≥23.9 kg/m2)；(7)合并高血壓：參照指南進行判定[9]；(8)合并糖尿病：參照指南進行判定[10]。

1.2.4實驗室指標檢測方法 全部患者均于化療前，采集清晨空腹靜脈血10 mL，共分為5支試管。(1)白細胞計數、中性粒細胞：使用長沙英泰儀器有限公司的TD4A型低速醫(yī)用離心機，以1 500 r/min的離心速度共離心5 min，離心半徑10 cm，離心完畢后取上清液待檢。使用日本Sysmxe公司的XE-2100全自動血液分析儀檢測白細胞計數、中性粒細胞。(2)C-反應蛋白(CRP)、血紅蛋白：經離心機分別進行離心處理，離心速度均為3 000 r/min，離心時間均為10 min，離心半徑均為15 cm，離心完畢后均取上清液待檢。使用武漢明德生物科技股份有限公司的試劑盒，采用化學發(fā)光免疫分析法測定CRP水平。使用日本希森美康XS-800i血細胞分析儀測定血紅蛋白水平。(3)血清糖類抗原(CA)125、CA199：經離心機進行離心處理，以8 000 r/min的離心速度共離心6 min，離心半徑16 cm，離心完畢后取上清液待檢。使用上海酶聯生物科技有限公司的試劑盒，采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清CA125、CA199水平。(4)血清miR-671-3p、miR-135b：經離心機進行離心處理，以3 000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心半徑15 cm，離心完畢后取上清液待檢。以總RNA 5 μL為模板，使用美國應用生物系統公司的試劑盒進行逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。總反應體系為15 μL，反應條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-671-3p的正向引物序列：5′-TCCGGTTCTCAGGGC-3′；反向引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。內參基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCACCATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGC TTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。miR-135b的正向引物序列：5′-GTCTCGAGCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；反向引物序列：5′-TAAAGCTTCTGGATACGACCACATA-3′。內參基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGCTTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。以cRNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。擴增條件： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-671-3p mRNA相對表達量和miR-135b mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1各組患者基線資料對比 耐藥組和敏感組的基線資料對比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者基線資料對比

續(xù)表1 兩組患者基線資料對比

2.2兩組患者實驗室指標對比 耐藥組的血清miR-671-3p mRNA相對表達量低于敏感組，miR-135b mRNA相對表達量高于敏感組，差異有統計學意義(P<0.05)，組間其他實驗室指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者實驗室指標對比[M(P25，P75)]

2.3老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對表達量與miR-135b mRNA相對表達量的相關性 Spearman相關分析顯示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對表達量與miR-135b mRNA相對表達量呈負相關(r=-0.359，P<0.001)。相關性散點圖見圖1。

圖1 老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對表達量與miR-135b mRNA相對表達量的相關性散點圖

2.4血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量與老年乳腺癌患者化療耐藥性關系的回歸分析 將基線資料與實驗室指標分析結果得到有意義的變量(均為連續(xù)變量)作為自變量，將老年乳腺癌患者化療耐藥性情況作為因變量(1=耐藥，0=敏感)，經二元回歸分析后，將P值放寬至<0.2，將符合條件的因素同時納入作為自變量，經多元Logistic回歸分析結果顯示，老年乳腺癌患者化療前1 d時的血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量與患者化療耐藥性有關，血清miR-671-3p mRNA相對表達量高表達是老年乳腺癌患者化療耐藥性的保護因素(OR<1，P<0.05)；miR-135b mRNA相對表達量高表達是老年乳腺癌患者化療耐藥性的危險因素(OR>1，P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量與老年乳腺癌患者化療耐藥性關系的回歸分析

2.5血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量預測老年乳腺癌患者化療耐藥性風險的效能分析 將患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量作為檢驗變量，老年乳腺癌患者化療耐藥情況作為狀態(tài)變量(1=耐藥，0=敏感)，繪制ROC曲線(見圖2)，結果顯示，老年乳腺癌患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量預測化療耐藥性風險的AUC均>0.70，預測價值較理想，且以患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量cut-off值取1.035、2.420時，聯合預測的價值最好。相關參數見表4。

表4 血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量預測老年乳腺癌患者化療耐藥性風險的效能分析結果

圖2 血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135bmRNA相對表達量預測老年乳腺癌患者化療耐藥性風險的ROC曲線圖

3 討 論

化療已被證實是乳腺癌的重要治療方法，但部分患者化療后存在耐藥性，化療效果欠佳，腫瘤組織未見縮小，甚至仍有所增長，病情有所加重，且老年患者機體衰退，一旦發(fā)生化療耐藥性，預后風險進一步升高[11]。因此，為預防老年乳腺癌患者產生化療耐藥性，需早期預測患者化療耐藥性發(fā)生風險，并給出針對性建議。

研究指出，細胞凋亡與化療耐藥性密切相關，凋亡因子的異常表達可降低化療藥物對腫瘤細胞的促凋亡作用，從而提高化療耐藥風險[12]。miRNA已被研究證實可調節(jié)腫瘤細胞信號轉導通路，參與腫瘤細胞凋亡、浸潤轉移等過程[13]。作為miRNA的一種，miR-671-3p能誘導腫瘤細胞發(fā)生侵襲遷移、增殖等細胞學行為[14]。miR-135b基因位于第一號染色體，在多種癌癥疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究指出，miR-135b可通過激活Hippo通路，增強癌細胞的侵襲和轉移能力[15]。同時，miR-135b表達上調可刺激雌激素受體α、雄激素受體和缺氧誘導因子1α，從而促進三陰性乳腺癌細胞的增殖、生長[16]。結合上述血清miR-671-3p、miR-135b與腫瘤細胞的增殖、生長的關系，推測二者可能參與了老年乳腺癌化療耐藥的發(fā)生及發(fā)展。本研究經對比化療耐藥與敏感的老年乳腺癌患者的血清miR-671-3pmRNA相對表達量、miR-135bmRNA相對表達量，結果顯示，耐藥組的血清miR-671-3p mRNA相對表達量低于敏感組，miR-135b mRNA相對表達量高于敏感組，初步推測血清miR-671-3p、miR-135b可能與老年乳腺癌患者的化療耐藥性有關。進一步作回歸分析結果顯示，血清miR-671-3p、miR-135b與老年乳腺癌患者的化療耐藥性有關，血清miR-671-3p mRNA相對表達量低、miR-135b mRNA相對表達量高可能是老年乳腺癌患者化療耐藥性的風險因子，證實上述猜測。分析可能的原因如下：血清miR-671-3p的直接靶基因為DEPTOR蛋白，當其過表達時，可抑制DEPTOR蛋白發(fā)揮作用，從而影響下游基因的表達，繼而抑制乳腺癌細胞的侵襲、遷移等能力，降低化療耐藥性發(fā)生風險[17]。miR-135b可靶向抑制腫瘤抑制基因(APC基因)，促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移，提高化療耐藥性發(fā)生風險[18]。最后，本研究繪制ROC曲線分析血清miR-671-3p、miR-135b預測老年乳腺癌患者化療耐藥性的價值，結果顯示，患者化療前1 d時的血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量預測老年乳腺癌患者化療耐藥性風險的AUC均>0.70，預測價值較理想，且以患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量cut-off值取1.035、2.420時，聯合預測的價值最好。表明血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量不僅可能是老年乳腺癌患者化療耐藥性的風險因子，也可作為老年乳腺癌患者化療耐藥性的預測標志物。上述結果也表明，早期可動態(tài)檢測老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量，若發(fā)現二者異常變化，建議可以提前為患者實施中西醫(yī)結合治療、免疫治療等干預，以改善血清miR-671-3p mRNA相對表達量、miR-135b mRNA相對表達量，可能對降低老年乳腺癌患者化療耐藥性風險有一定價值。此外，本研究還對患者血清miR-671-3p與血清miR-135b進行相關性分析，結果顯示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對表達量與miR-135b mRNA相對表達量呈負相關，提示老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對表達量與血清miR-135b mRNA相對表達量之間可能存在一定聯系，二者可能相互影響、相互作用，共同參與了老年乳腺癌患者化療耐藥性的發(fā)生，但尚不能根據此次研究結果推斷上述指標之間在疾病中相互影響，加之目前關于二者的關系研究甚少，具體關系及機制還需要在未來進一步開展更多的研究加以明確。

綜上所述，老年乳腺癌患者化療耐藥性可能與血清miR-671-3p、miR-135b表達異常有關，臨床可考慮通過早期監(jiān)測老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p、miR-135b表達，預測化療耐藥性風險并指導干預，可能對降低化療耐藥性、促進良性預后有積極意義。