血清miR-124-3p、TLR4水平在慢性阻塞性肺疾病患者中表達(dá)變化及臨床意義*

李欣欣,蔣彩花

山東省公共衛(wèi)生臨床中心：1.檢驗(yàn)科；2.漢光微生物實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250101

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征是持續(xù)性氣流阻塞，COPD是全世界發(fā)病率和病死率最高的疾病之一，在全球疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)中排名第5[1-2]。誘發(fā)COPD的因素較多，如呼吸道感染、吸煙、空氣污染等，但其發(fā)病機(jī)制尚不清晰。慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者出現(xiàn)病情惡化，如呼吸困難、痰量增加和痰膿脹等癥狀，AECOPD患者癥狀發(fā)作頻率增加，肺功能加速下降，生活質(zhì)量嚴(yán)重受損，同時(shí)病死率也明顯增加[3]。臨床上目前尚無(wú)治愈COPD的方法，但可通過(guò)多種療法緩解患者癥狀、減輕并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生活質(zhì)量[4]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性異常炎性反應(yīng)可促進(jìn)COPD的疾病進(jìn)展[5]。微小RNA(miRNA)是非編碼內(nèi)源性小RNA，可通調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)調(diào)控生物體中多種基本生命過(guò)程。miRNA-124-3p(miR-124-3p)是一種炎癥相關(guān)miRNA，在多種炎癥疾病中發(fā)揮重要作用，但其是否參與COPD的炎癥過(guò)程尚不清楚[6]。Toll樣受體4(TLR4)是天然免疫受體，可通過(guò)TLR4/核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)信號(hào)通路影響多種炎癥因子的表達(dá)，參與COPD患者的固有免疫反應(yīng)[7]。本研究觀察COPD患者血清miR-124-3p、TLR4水平變化，并分析其與患者肺功能、預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2018年3月至2019年12月收治的77例COPD患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[8]；(2)年齡40～75歲；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期、哺乳期女性；(2)合并其他肺部疾??；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)文獻(xiàn)[8]將COPD患者分為穩(wěn)定期32例(穩(wěn)定期組)和AECOPD患者45例(AECOPD組)。選取本院收治的單純呼吸道感染者38例作為感染組。另選取同期在本院體檢的健康者42例作為對(duì)照組，4組年齡、體重指數(shù)及性別比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，穩(wěn)定期組病程與AECOPD組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 4組一般資料比較

1.2方法

1.2.1樣本采集及保存 采集COPD患者入院后第2日清晨空腹肘靜脈血5 mL，對(duì)照組于體檢當(dāng)天、感染組于就診當(dāng)日采集空腹肘靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清保存于-20 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2.2qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平 取出血清樣本，采用RNA提取試劑盒[貨號(hào)：DP419，天根生化科技(北京)有限公司]提取樣本中的總RNA，檢測(cè)其純度、完整度，將滿足要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205313，德國(guó)QIAGEN公司)說(shuō)明操作，以所得cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR法，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平。miR-124-3p及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表2。

表2 miR-124-3p及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.3血清TLR4水平檢測(cè) 取出血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清TLR4水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4一般指標(biāo)檢測(cè) 記錄各組受試對(duì)象的年齡、性別、體重指數(shù)等資料。采用肺功能儀檢測(cè)用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)，并計(jì)算FEV1/FVC。

1.3隨訪 AECOPD組患者出院后進(jìn)行為期1年的隨訪，統(tǒng)計(jì)其預(yù)后情況。預(yù)后不良：AECOPD組患者病情進(jìn)展，再入院或死亡；預(yù)后良好：AECOPD組患者病情得到有效控制。

2 結(jié) 果

2.14組血清miR-124-3p、TLR4水平比較 感染組、穩(wěn)定期組、AECOPD組血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。穩(wěn)定期組、AECOPD組血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平低于感染組，血清TLR4水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平低于穩(wěn)定期組，AECOPD組血清TLR4水平高于穩(wěn)定期組及感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組血清miR-124-3p、TLR4水平比較

2.24組肺功能指標(biāo)水平比較 感染組FEV1/FVC低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；感染組FEV1、FVC與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；穩(wěn)定期組、AECOPD組FEV1、FVC及FEV1/FVC均低于對(duì)照組、感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AECOPD組FEV1、FVC及FEV1/FVC均低于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組肺功能指標(biāo)水平比較

2.3AECOPD組血清miR-124-3p、TLR4水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 AECOPD組血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.05)，血清TLR4水平與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，血清miR-124-3p與TLR4呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 AECOPD組血清miR-124-3p、TLR4水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4AECOPD組不同預(yù)后患者血清miR-124-3p、TLR4水平比較 AECOPD組隨訪1年后，預(yù)后不良者共20例，預(yù)后良好者25例。預(yù)后不良者血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平低于預(yù)后良好者，血清TLR4水平高于預(yù)后良好者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 AECOPD組不同預(yù)后患者血清miR-124-3p、TLR4水平比較

2.5血清miR-124-3p、TLR4水平對(duì)AECOPD組預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值 血清miR-124-3p、TLR4水平預(yù)測(cè)AECOPD組預(yù)后不良的曲線下面積分別為0.822、0.707，截?cái)嘀捣謩e為0.55、3.36 ng/mL，靈敏度分別為85.0%、90.0%，特異度分別為80.0%、52.0%；二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)AECOPD組預(yù)后不良的曲線下面積為0.854，靈敏度為85.0%，特異度為76.0%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-124-3p、TLR4水平預(yù)測(cè)AECOPD組預(yù)后不良的ROC曲線

3 討 論

COPD現(xiàn)已被公認(rèn)為是一種異質(zhì)性疾病，這種臨床異質(zhì)性由生物學(xué)異質(zhì)性體現(xiàn)，研究生物標(biāo)志物可能有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)COPD的新療法，并有助于提出更為有效的治療決策[9]。COPD患者存在持續(xù)性的慢性炎癥及進(jìn)行性氣流受限，這是造成氣道和肺部結(jié)構(gòu)永久改變的原因[10]。其中氣道炎性反應(yīng)是COPD發(fā)病過(guò)程的關(guān)鍵因素之一，因此本研究通過(guò)探討炎癥相關(guān)因子miR-124-3p、TLR4在COPD患者血清中的表達(dá)及意義，期望尋找到特異性生物標(biāo)志物，為提高COPD患者臨床療效提供幫助。

越來(lái)越多的研究表明，miR-124-3p在多種人類癌癥中起抑癌作用，包括乳腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、肝細(xì)胞癌和膀胱癌等，miR-124-3p可抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明miR-124-3p在炎癥中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞模擬肝缺血/再灌注損傷的炎癥狀態(tài)，此時(shí)上調(diào)miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平可抑制炎性反應(yīng)，改善肝損傷[12]。另有研究顯示，miR-124-3p模擬物能有效抑制LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子分泌及巨噬細(xì)胞mRNA表達(dá)，miR-124-3p高表達(dá)能夠減弱嚴(yán)重社區(qū)獲得性肺炎患者的炎性反應(yīng)，可能是通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮作用[13]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平由高到低分別為對(duì)照組、感染組、穩(wěn)定期組、AECOPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且AECOPD組血清miR-124-3p相對(duì)表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，提示miR-124-3p可能參與COPD患者的疾病進(jìn)展。

TLR4是參與脂質(zhì)識(shí)別的膜相關(guān)受體，其主要配體是LPS/內(nèi)毒素，革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分。TLR4可誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子釋放，TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及多種調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-κB，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄因子家族(STAT1)、激活蛋白1(AP1)等[14]。TLR4在COPD炎癥過(guò)程的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，參與局部和全身炎癥、病情發(fā)展及對(duì)T輔助免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，TLR4信號(hào)通路的過(guò)度激活可能促進(jìn)COPD的進(jìn)展[15]。趙靜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血及肺組織中TLR4呈高表達(dá)，且隨著病情加重而增加，與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。本研究中，感染組血清TLR4水平高于對(duì)照組，F(xiàn)EV1及FVC低于對(duì)照組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)EV1/FVC顯著低于對(duì)照組，感染組肺功能有所下降，TLR4水平無(wú)特異性變化；穩(wěn)定期組、AECOPD組患者血清TLR4水平高于對(duì)照組，AECOPD組血清TLR4水平高于穩(wěn)定期組及感染組，且AECOPD患者血清TLR4水平與FEV1、FVC、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果一致，提示TLR4在AECOPD患者中特異性表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)COPD患者的炎癥過(guò)程參與COPD的疾病進(jìn)展。

SU等[17]通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-124-3p對(duì)TLR4有靶向調(diào)控作用。在病毒性肺炎小鼠中過(guò)表達(dá)miR-124-3p可降低TLR4及NF κB p65的表達(dá)，miR-124-3p可能通過(guò)靶向TLR4阻斷NF κB通路抑制炎性反應(yīng)[6]。本研究中，AECOPD患者血清miR-124-3p與TLR4呈負(fù)相關(guān)，二者共同作用參與COPD的發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，AECOPD組預(yù)后不良者血清miR-124-3p水平低于預(yù)后良好者，血清TLR4水平高于預(yù)后良好者，血清miR-124-3p、TLR4水平預(yù)測(cè)AECOPD組預(yù)后不良的曲線下面積分別為0.822、0.707，二者均對(duì)AECOPD患者預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高，提示檢測(cè)miR-124-3p、TLR4水平可預(yù)估患者預(yù)后，對(duì)于所預(yù)測(cè)的預(yù)后不良患者盡早采取治療，或可改善患者預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量。

綜上所述，COPD患者血清miR-124-3p呈低表達(dá)，TLR4水平呈高表達(dá)，二者水平與COPD患者疾病嚴(yán)重程度及肺功能有關(guān)，并可預(yù)測(cè)AECOPD患者預(yù)后情況。但本研究中樣本量較少，miR-124-3p、TLR4對(duì)AECOPD患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能否廣泛應(yīng)用于臨床中仍需大樣本數(shù)據(jù)支持。