CYP2D6*10基因多態性檢測體系的建立與評價*

吳建元，章柏鈺，蔡君龍，汪再興，劉鳳麟，曾 超，黃建英△

1.武漢大學中南醫院臨床試驗中心,湖北武漢 430071；2.武漢友芝友醫療科技股份有限公司,湖北武漢 430075

細胞色素P-450(CYP450)屬于單氧酶，代表亞鐵血紅素蛋白家族，因其在450 nm有特異吸收峰而得名。CYP2D是CYP家族重要成員，其基因位于22號染色體上，由CYP2D6、CYP2D7、CYP2D8組成，其中CYP2D7P和CYP2D8P為假基因，僅有CYP2D6能夠在肝臟及其他組織中表達，編碼酶活性蛋白，發揮代謝作用。人群中CYP2D6的活性呈現強代謝者、中間代謝者、弱代謝者和超強代謝者四態分布的現象。CYP2D6在藥物代謝中起重要作用。去甲替林等抗抑郁藥，奮乃靜、硫利達嗪等抗精神病藥物、美托洛爾等抗心律失常藥物主要由CYP2D6代謝，CYP2D6活性會影響其血藥濃度，進而影響其療效及不良反應[1-2]。此外，CYP2D6多態性與三環類抗抑郁藥、選擇性血清素再攝取抑制劑、昂丹司瓊和托烷司瓊等藥物用藥的關聯已經有相關臨床藥物基因組學實施聯盟(CPIC)指南[3-6]。與其他大部分CYP同工酶不同，CYP2D6對于酶誘導效應并不敏感。不同基因型對酶活性和藥物代謝的影響不一。中國人群中CYP2D6最常見的導致酶活性降低的等位基因為CYP2D6*10(C188T)，等位基因頻率為53%[7]。

因此，臨床上需要快速準確的手段對CYP2D6進行分型檢測，尤其是在中國人群分布廣泛的CYP2D6*10基因型。由于CYP2D6、CYP2D7、CYP2D8高度同源，如CYP2D6和CYP2D7同源性超過95%，極易干擾CYP2D6基因的檢測結果。核酸檢測時應重點排除CYP2D7和CYP2D8的影響。目前國內外針對CYP2D6分型，多采用Sanger直接測序法、PCR高分辨率溶解曲線法等，這些方法均存在著一定的局限性，如需要特殊儀器、操作復雜等。本研究以當前臨床實驗室普遍采用的熒光定量PCR平臺，采用Taqman探針分型技術結合擴增阻滯突變聚合酶鏈式反應(ARMS-PCR)技術，建立一種適用多種類型臨床樣本(抗凝全血、石蠟組織切片等)的快速檢測CYP2D6*10基因的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝全血、枸櫞酸鈉抗凝全血、石蠟組織切片，每種樣本類型CYP2D6*10 3種基因型(C/C野生型，T/T純合突變型，C/T雜合突變型)各20例。本研究經武漢大學中南醫院醫學倫理委員會批準，倫理批件號為科倫[2021083]，研究樣本的收集與使用均在倫理委員會監督下進行。

1.2儀器與試劑 ABI7500熒光定量PCR系統；德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit(貨號51104)或武漢友芝友醫療科技股份有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒(貨號YZYMT-028)用于提取全血樣本、德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(貨號56404)或武漢友芝友醫療科技股份有限公司的核酸提取試劑盒(貨號YZYMT-029)用于提取石蠟組織樣本；TaKaRa TaqTMHS PCR Kit-UNG plus(TaKaRa，貨號R013A)；引物及探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1樣本類型選擇與提取試劑盒測試 在進行核酸檢測前，需要對樣本中的核酸進行提取/純化。該步驟可最大量分離出目的核酸外，還可對核酸進行純化，盡可能去除血液或組織中會對后續PCR檢測產生抑制作用的血紅素、蛋白質和脂類物質等。核酸提取的質量，直接影響后續的檢測體系的性能。

與CYP2D6活性相關的藥物極多，用途也很廣泛，檢測CYP2D6*10的體系需要可以兼容盡可能多的臨床樣本類型。從易于獲取、以便于保藏、減輕患者痛苦等方面考慮，選擇抗凝全血和石蠟包埋組織作為樣本。臨床常見的抗凝劑中，肝素會抑制Taq 酶的活性，所以選用EDTA或枸櫞酸(ACD)鹽抗凝全血作為全血樣本。

隨機選取EDTA和枸櫞酸鈉抗凝全血各5例，使用德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit(貨號51104)和武漢友芝友醫療科技股份有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒(貨號YZYMT-028)兩種血液基因組DNA提取試劑盒，對同一樣本都提取200 μL全血1次，使用相同的100 μL體積洗脫1次，使用NanoDrop One檢測提取的基因組DNA的濃度及純度，比較兩種提取試劑盒的提取效能。

隨機選取5例石蠟包埋組織，使用德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(貨號56404)或武漢友芝友醫療科技股份有限公司的核酸提取試劑盒(磁珠法，貨號YZYMT-029)兩種石蠟包埋組織 DNA提取試劑盒，對同一樣本使用相同數量的組織切片進行DNA提取，使用相同的100 μL體積洗脫1次，使用NanoDrop One檢測提取的基因組DNA的濃度及純度，比較兩種提取試劑盒的提取效能。

1.3.2引物探針設計與擴增體系建立 CP2D6*10的代表單核苷酸多態性(SNP)-rs1065852(C188T)為檢測靶標，設計特異性擴增包含該位點的引物，為了覆蓋周圍序列存在的SNP，同時利用擴增阻滯突變聚合酶鏈式反應(ARMS-PCR)技術特異性區分CYP2D7序列，設計2條不同的下游引物用于含有周圍不同SNP的序列的擴增。正向引物：5′-CCTGATGCACCGGCG-3′；反向引物1：5′-TGGTCCAGCCTGTGGTTT-3′；反向引物2：5′-GCAGGGGGCCTGGTA-3′。設計覆蓋識別的SNP位點，分別對應不同基因型的探針，野生型探針WP：5′-FAM-CACGCTAACCACCAG-MGB-3′；突變型探針：5′-VIC-CTGGTGAGTAGCGT-MGB-3′。

為了監測熒光定量PCR反應是否順利進行、體系中是否添加了正常的DNA樣本、提取的樣本是否含有抑制PCR反應的物質，設計了針對人看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的特異性內標引物及探針，用于監控PCR反應的進行。內標上游引物：5′-GGCCACTAGGCGCTCA-3′；內標下游引物：5′-GCCACCCGCGAACTCA-3′;內標探針：ROX-5′-CTCCCTCCGCGCAGCCG-3′-BHQ2。

配制并優化CYP2D6*10熒光PCR檢測體系，優化體系內的引物和探針濃度，使體系檢測雜合型時兩個通道的信號及循環數閥值(Ct值)接近，使體系對野生型模板和突變型模板的檢測能力相近。建立體系為總體積25 μL，含1×濃度的含尿嘧啶糖基化酶的PCR緩沖液(PCR Buffer for UNG plus)，2.25 mmol/L Mg2+，內含0.6 mmol/L的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)和 0.2 mmol/L的脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)的脫氧核糖核苷三磷酸混合液(dU plus dNTP Mixture)，0.625 U TaKaRa Taq HS，0.5 U尿嘧啶-N-糖基化酶，400 nmol/L 引物F、R1和R2；200 nmol/L 探針WP和MP；200 nmol/L內標上游和下游引物；100 nmol/L內標探針，0.2～200.0 ng血液或石蠟組織提取的基因組DNA。

測試退火溫度、退火時間、循環數等反應條件，優化的反應條件：37 ℃,10 min，95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環，于60 ℃退火步驟末采集FAM、VIC和ROX通道熒光信號。

1.3.3性能評價 為了驗證CYP2D6*10基因多態性檢測體系是否受同源序列干擾，將檢測的序列放入美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫進行blast數據庫比對，將同源序列與內標序列共同構建到pUC57質粒之中構成CYP2D7質粒，用于驗證檢測體系的特異性。選取已知CYP2D6*10基因純合野生、純合突變和雜合突變基因型的EDTA抗凝全血、枸櫞酸鈉抗凝全血和石蠟組織各20例樣本，采用本研究建立的方法進行檢測，確定樣本適用類型。分別選取已知CYP2D6*10基因純合野生、純合突變和雜合突變基因型的濃度為100 ng/μL的基因組DNA，配制100.0、60.0、30.0、10.0、5.0、0.5 和0.1 ng/μL的濃度梯度，然后采用本研究建立的方法進行檢測，以評價本方法的靈敏度。選取抗凝全血和石蠟組織切片，每種樣本類型CYP2D6*10 3種基因型(野生、雜合突變、純合突變)已知樣本各20例，采用本研究建立的方法進行檢測，與直接測序確定基因型進行比較，評價本方法的準確性。

2 結 果

2.1樣本提取試劑盒的選擇 德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit和武漢友芝友醫療科技股份有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒對EDTA和枸櫞酸鈉抗凝全血樣本的提取的基因組DNA的質量比對結果見表1樣本序號1～10所示。

表1 DNA提取試劑盒提取質量對比

續表1 DNA提取試劑盒提取質量對比

從提取的DNA的純度及濃度測定結果來看，二者都可以提取出EDTA和枸櫞酸鈉抗凝全血中的基因組DNA。同樣的200 μL全血，同樣的100 μL體積洗脫，兩種試劑盒提取基因組DNA濃度雖有差別，但都在30 ng/μL以上；武漢友芝友醫療科技股份有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取的基因組DNA的純度稍好于德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit，但都可以用于后續檢測。

對于石蠟包埋組織 DNA提取試劑盒的選擇，本研究選用德國QIAGEN GmbH公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和武漢友芝友醫療科技股份有限公司的核酸提取試劑盒兩種常見的石蠟包埋組織 DNA提取試劑盒進行提取效果對比。隨機選取石蠟包埋組織各5例，使用兩種試劑盒，按照各自的試劑盒說明書，對同一樣本都取10 μm切片3片并提取1次，均使用100 μL體積洗脫，使用NanoDrop One檢測提取的基因組DNA的濃度，比較兩種試劑盒的提取效能，結果見表1樣本序號11～15所示，并且從提取的DNA的濃度測定結果來看，二者提取相同的石蠟組織獲得的基因組DNA量比較相近，都可以用于后續檢測。

2.2CYP2D6*10熒光PCR檢測體系的建立 本研究建立的 CYP2D6*10基因熒光 PCR 檢測體系，經過對體系內引物、探針濃度的優化之后，檢測CYP2D6*10野生型FAM通道有 S 型擴增曲線，VIC通道擴增信號出現；檢測CYP2D6*10純合突變型VIC通道有 S 型擴增曲線，FAM通道擴增信號出現；檢測CYP2D6*10雜合突變型FAM通道和VIC通道均有 S 型擴增曲線，可有效區分不同基因型。檢測不同基因型樣本，內標ROX通道均有S 型擴增曲線，可有效指示PCR反應的進行，見圖 1、表2。

注：A為CYP2D6*10野生型模板擴增結果,B為CYP2D6*10純合突變型模板擴增結果,C為CYP2D6*10雜合突變型模板擴增結果；1為FAM通道，2為VIC通道，3為ROX通道。

表2 不同CYP2D6*10基因型的檢測Ct值

從圖1及表2顯示的結果來看，設計的引物和探針對3種不同基因型(野生型、純合突變型、雜合突變型)有識別能力，這一檢測體系可以作為初始體系，并對該檢測體系的擴增程序的進行了優化，分別對退火溫度、延伸時間和循環數進行測試。見圖2～4。

注：A為CYP2D6*10野生型模板58 ℃退火擴增結果,B為CYP2D6*10野生型模板60 ℃退火擴增結果,C為CYP2D6*10野生型模板62 ℃退火擴增結果；1為FAM通道，2為VIC通道，3為ROX通道。

注：A為CYP2D6*10野生型模板退火45 s擴增結果,B為CYP2D6*10野生型模板退火60 s擴增結果,C為CYP2D6*10野生型模板退火70 s擴增結果；1為FAM通道，2為VIC通道，3為ROX通道。

注：A為CYP2D6*10野生型模板擴增35個循環的結果,B為CYP2D6*10野生型模板擴增40個循環的結果,C為CYP2D6*10野生型模板擴增45個循環的結果；1為FAM通道，2為VIC通道，3為ROX通道。

體系隨著退火溫度升高，體系特異性提高，但是目標信號值下降，S型曲線拐點滯后，說明擴增效率隨之降低。60 ℃退火的特異性優于58 ℃，擴增效率優于62 ℃，因此優選退火溫度為60 ℃；延伸時間為45 s時，體系擴增曲線拐點不明顯，且擴增信號值較低；延伸時間為60 s和70 s時，擴增曲線無明顯差異，考慮擴增時間，延伸時間選擇60 s；循環數為35個循環時，體系擴增信號值太低，S型不明顯；循環數為45個循環時，程序運行時間延長；循環數為40個循環時信號值優于循環數為35個循環時的信號值，并且與循環數為45個循環時的信號值無明顯差異，可以滿足需求，因此選擇循環數為40個循環進行PCR擴增。優化后的擴增程序：37 ℃,10 min，95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環，于60 ℃退火步驟末采集FAM、VIC和ROX通道熒光信號。

2.3CYP2D6*10熒光定量PCR檢測體系性能驗證 對CYP2D6*10基因多態性檢測體系所要檢測的序列的同源序列進行系統分析，將其序列放入NCBI數據庫進行blast數據庫比對。顯示CYP2D7基因與CYP2D6*10基因野生型有94%的一致率。這表明檢測體系的擴增區域與CYP2D7基因同源性極高，有一定的非特異性擴增的風險。將選定的CYP2D7序列及內標序列共同構建到pUC57質粒之中，獲得CYP2D7質粒，使用CYP2D6*10熒光PCR檢測體系，分別檢測30 000、20 000、10 000、600、150和30 copy/μL的CYP2D7質粒，見表3。

表3 CYP2D7質粒檢測結果

由表3檢測結果可知，檢測體系擴增最可能產生干擾的CYP2D7同源基因，FAM和VIC通道均無擴增，說明檢測體系可以很好的區分同源序列，特異性能符合要求。本研究建立的方法進行檢測，其檢測結果與Sanger直接測序法結果符合率為100%，見表4，而且由表4檢測結果可知，本研究建立的CYP2D6*10檢測體系可以對EDTA抗凝全血、枸櫞酸鈉抗凝全血和石蠟包埋組織的CYP2D6*10基因多態性進行準確的檢測。

表4 本方法與Sanger直接測序法結果一致性比較

檢測濃度分別為30 000、18 000、9 000、4 500、1 500、150和30 copy/μL的CYP2D6*10基因型為野生型、純合突變型和雜合突變型的基因組DNA，檢測20次，見表5，而且由表5結果可見，本研究建立的CYP2D6*10基因熒光PCR檢測體系都可以100%準確檢出CYP2D6*10基因不同的基因型，靈敏度較高。

表5 靈敏性檢測結果

3 討 論

CYP2D6在藥物代謝中起重要作用。CYP2D6基因多態性會影響其酶活性，造成藥物血藥濃度波動，進而影響其療效及不良反應[8-9]。

他莫昔芬(TAM)屬于三苯乙烯非甾體類抗雌激素受體拮抗劑，通過與雌激素競爭結合雌激素受體，從而抑制乳腺癌細胞的增殖，廣泛應用于雌激素受體陽性乳腺癌的治療。國內外的大量研究證實，CYP2D6的基因多態性，尤其是CYP2D6*10基因多態性，與乳腺癌患者服用TAM的療效密切相關[10-12]。CPIC、荷蘭藥物遺傳學工作組(DPWG)、加拿大藥物基因組學藥物安全網絡(CPNDS)臨床推薦小組，都建議根據CYP2D6代謝強弱指導TAM的用藥[13-15]。2015年國家衛生和計劃生育委員會醫政醫管局發布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》中指出攜帶“CYP2D6*10等位基因的患者他莫昔芬的療效欠佳”[7]。CYP2D6基因多態性對其他大量藥物的其療效及不良反應也有重要的影響。如精神類藥物去甲替林、帕羅西汀，抗心律失常藥物美托洛爾、美西律等。

開展中國人群的CYP2D6*10基因多態性檢測可以預測CYP2D6酶活性，能為相關藥物使用提供指導。目前國內外針對CYP2D6分型，一般采用Sanger直接測序法。該方法需要對測序樣品擴增、純化、序列分析，過程比較繁瑣、耗時長，且對取材和技術要求比較高，在臨床應用中有一定的局限性。另一種常用方法是高分辨率溶解曲線法，該方法對設備要求較高，要求設備溫度控制及均一性達到較高水平，且對待分析DNA樣本的濃度及純度有較高的要求，此外，該方法設備運行時間長，結果分析復雜。

熒光定量PCR技術操作簡單、設備要求較低、設備運行時間短，通量大，已經成為臨床常用的檢測方法。本研究基于熒光定量PCR技術平臺，采用Taqman探針分型技術結合擴增阻滯突變聚合酶鏈式反應(ARMS-PCR)技術，建立了一種適用多種類型臨床樣本(抗凝全血、石蠟組織切片等)的快速檢測CYP2D6*10基因的方法。該方法適用樣本類型多，檢測的靈敏度高、準確性好，將極大促進CYP的科學及臨床研究。