miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在食管鱗癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

趙 靜,李 良,郟莉莉

1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)/南京市大廠醫(yī)院,江蘇南京 210048;2.江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇南京 210000

食管癌是目前臨床上常見的消化道腫瘤之一，食管鱗癌是食管癌兩大病理類型之一，具有較好的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，癌腫甚至可侵入氣管、支氣管，形成食管、氣管或支氣管瘺等，嚴(yán)重影響患者日常生活和工作[1-3]。目前臨床上治療此病多采取綜合治療，但易受病理類型、手術(shù)效果及個(gè)體差異等影響，導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)率較高[4]。目前對(duì)于食管鱗癌發(fā)病的具體分子機(jī)制尚未得到統(tǒng)一言論，分子生物學(xué)亦成為學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)，其可通過分子水平尋找基因突變位點(diǎn)進(jìn)而了解食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制[5]。故明確食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于此病的早期診斷、治療及預(yù)防具有重要的價(jià)值意義。微小核糖核酸-330-3p(miR-330-3p)、FAM83H、長(zhǎng)鏈非編碼RNA 小核仁RNA宿主基因7(LncRNA SNHG7)分別在乳腺癌、胃癌、卵巢癌中有所報(bào)道，但暫無三者聯(lián)合在食管鱗癌中報(bào)道，故本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征之間的相關(guān)性，為尋找食管鱗癌臨床治療方案的確定提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年11月至2020年11月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)和江蘇省腫瘤醫(yī)院接診的114例食管癌患者作為研究對(duì)象，男61例、女53例，年齡35～74歲，平均(46.23±4.38)歲，體重指數(shù)(BMI)為 24～35 kg/m2，平均BMI(28.62±2.93)kg/m2，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期69例、Ⅲ期28例、Ⅳ期17例；分化程度：低分化12例、中分化59例、高分化43例。所有研究對(duì)象及家屬均知情同意本研究，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào)：(2016)倫審第(58)號(hào)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合文獻(xiàn)[6]中診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)首次確診；(3)患者經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查診斷為食管鱗癌；(4)術(shù)前未行放、化療等抗腫瘤治療，TNM分期和分化程度明確；(5)食吞鋇X線、食管鏡可見官腔狹窄、黏膜破壞且食管脫落細(xì)胞檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全；(2)入院治療前行放化療等治療；(3)合并Barrett食管炎或反流性食管炎；(4)其他腫瘤轉(zhuǎn)移至食管。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 標(biāo)本取自手術(shù)切除的無壞死食管鱗癌腫瘤組織及遠(yuǎn)端正常食管組織(距病灶>5 cm，經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn))，新鮮切除的癌組織及癌旁組織，將制作的組織標(biāo)本采用40 g/L 多聚甲醛進(jìn)行固定，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 μm。

1.2.2miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表達(dá)，步驟如下：提取食管鱗癌組織、癌旁組織中加入變性溶液、酸化苯酚氯仿，混勻1 min，提取上清液并且記錄其體積，再往上清液中加入1/3體積濃度為100%的乙醇充分混勻以后通過第1個(gè)過濾柱；收集過濾液并記錄其體積，再次往過濾液中加入其體積2/3濃度為100%的乙醇，充分混勻后通過第2個(gè)過濾柱；再用95 ℃無RNA酶水洗脫出總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。miR-330-3p上游引物：5′-TTGCAGCACAGTAAAACATG-3′，下游引物：5′-GATAAGCACTCCACAACCAG-3′；LncRNA SNHG7上游引物：5′-TTGCTGGCGTCTCGGTTAAT-3′，下游引物：5′- GGAAGTCCATCACAGGCGAA-3′；FAM83H上游引物：5′-CTAGGGACTGGGCTGCT-3′，下游引物：5′-AGGGTCTTAGGTTCCAGGCA-3′。內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列上游：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游：5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸6 min，Ct值(2-ΔΔCt)法表示miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較 癌組織中miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在 癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較

2.2miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7與食管鱗癌患者臨床特征的關(guān)系分析 如表2所示，miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7與食管鱗癌患者性別、年齡、病變位置無關(guān)(P>0.05)。miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7與食管鱗癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、預(yù)后情況、TNM分期有關(guān)，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深浸潤(rùn)、預(yù)后不良、Ⅲ～Ⅳ期食管鱗癌患者miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表達(dá)高于高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淺浸潤(rùn)、預(yù)后良好、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7與食管鱗癌患者臨床特征的關(guān)系分析

2.3ROC曲線分析miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值 三者聯(lián)合對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值高于miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7單項(xiàng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 ROC曲線分析miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值

圖1 miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7

2.4相關(guān)性分析 FAM83H與miR-330-3p呈正相關(guān)(r=0.914，P=0.001)；LncRNA SNHG7與FAM83H呈正相關(guān)(r=0.867，P=0.001)；miR-330-3p與LncRNA SNHG7呈正相關(guān)(r=0.902，P=0.001)。見圖2。

圖2 miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7的相關(guān)性

3 討 論

食管癌是我國(guó)發(fā)病率位于第四位的惡性腫瘤，食管鱗癌占食管癌的比例高達(dá)70%，該病患者病死率較高且預(yù)后較差，目前臨床上對(duì)于食管鱗癌預(yù)后的臨床指標(biāo)暫無定論，故尋找新的分子預(yù)后標(biāo)志物，有助于臨床醫(yī)者制訂個(gè)性化治療策略、延長(zhǎng)生存期[7-8]。miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7等許多生物分子對(duì)食管鱗癌患者預(yù)后產(chǎn)生一定影響。

miR-330-3p在食管鱗癌中表達(dá)狀態(tài)可能具有一定組織特異性，而關(guān)于miR-330-3p在其他腫瘤中的表達(dá)狀態(tài)有所爭(zhēng)議[9]。有研究顯示[10]，miR-330-3p在膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)上調(diào)，卻在前列腺癌中表達(dá)下降，如此復(fù)雜的表達(dá)狀態(tài)提示了miR-330-3p在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用，miR-330-3p可以顯著加快食管鱗癌細(xì)胞體內(nèi)、體外生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并且可抵抗由順鉑引起的細(xì)胞凋亡。miR-330-3p表達(dá)升高可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，相反miR-330-3p的異常表達(dá)被認(rèn)為可以抑制前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。隨著對(duì)miRNAs研究的不斷深入，越來越多的發(fā)揮多面性作用miRNAs被人們熟知，比如miR-9可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，卻能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖；可以通過激活β-catenin信號(hào)通路而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，卻又能靶向調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶14而發(fā)揮抑制神經(jīng)母細(xì)胞癌細(xì)胞血管生成的作用，這些都證實(shí)了miRNAs可以在不同腫瘤中發(fā)揮復(fù)雜多樣的作用[12-13]。

FAM83H是FAN83家族8位成員之一，其基因N端附近存在一段保守且功能未知的結(jié)構(gòu)域，且這一結(jié)構(gòu)可能與致瘤性相關(guān)，臨床研究結(jié)果顯示，其在肝癌、骨肉瘤、宮頸瘤等惡性腫瘤組織中呈異常高表達(dá)[14-15]。李景攀等[16]研究報(bào)道，F(xiàn)AM83A位于8q24.13，其在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)異常及對(duì)非小細(xì)胞肺癌預(yù)后和診斷的作用，其還與骨形成蛋白BMP信號(hào)通路、KRAS信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等有密切關(guān)系，低表達(dá)FAM83A可通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤生長(zhǎng)，為非小細(xì)胞肺癌中的功能開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。馮博等[17]等研究報(bào)道，F(xiàn)AM83H在食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)，表明其在食管鱗癌中通過參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮癌基因的作用，其可食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，且其表達(dá)水平與病理學(xué)分化程度相關(guān)。在本研究中，F(xiàn)AM83H在食管鱗癌組織中呈異常高表達(dá)，證實(shí)其可能參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮促癌作用且與食管鱗癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、臨床分期有關(guān)。

LncRNA SNHG7已被證實(shí)在乳腺癌、肝癌中表達(dá)異常升高，其在乳腺癌中可通過miR-34a啟動(dòng)EMT和Notch-1通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，在肝癌中高表達(dá)LncRNA SNHG7可發(fā)揮癌基因的作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[18]。陳偉泉等[19]研究報(bào)道，LncRNA SNHG7在舌癌組織中低表達(dá)，可能與miR-9-5p相互作用，SNHG7內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-9-5p，從而上調(diào)靶基因Ambral表達(dá)，進(jìn)而抑制舌癌細(xì)胞增殖。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，多表現(xiàn)出較高的組織特異性，可以RNA形式在基因轉(zhuǎn)錄等多個(gè)層面參與調(diào)控基因表達(dá)情況；SNHG7的RNA序列長(zhǎng)度約為2 157 bp，其在食管鱗癌中作為致癌基因參與疾病發(fā)生、發(fā)展，且與食管鱗癌嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展有關(guān)[20-21]。在本研究中，LncRNA SNHG7在食管鱗癌組織中呈異常高表達(dá)，且與患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、臨床分期有關(guān)，其原因可能為L(zhǎng)ncRNA SNHG7可指導(dǎo)核仁小分子RNA進(jìn)行翻譯后修飾，而核仁小分子RNA參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83H與miR-330-3p呈正相關(guān)；LncRNA SNHG7與FAM83H呈正相關(guān)；miR-330-3p與LncRNA SNHG7呈正相關(guān)。

綜上所述，miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7與食管鱗癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、臨床分期有關(guān)，miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7之間呈正相關(guān)，且均參與食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展過程，升高miR-330-3p、FAM83H水平，降低LncRNA SNHG7水平，能夠有效抑制食管鱗癌的發(fā)展，可成為食管鱗癌診斷的一種新手段，為食管鱗癌的早期診治提供一定的理論參考。本研究存在樣本量小、病例來源局限等不足，研究結(jié)果仍需大量樣本、多中心試驗(yàn)研究的進(jìn)行進(jìn)一步確定。