血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p在非小細胞肺癌中的表達及其診斷價值

魏 萍

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院腎內科腎病實驗中心，山東濟南 250031

肺癌是全球發病率高居第二位、病死率位居第一的惡性腫瘤[1-2]。肺癌的病理學分類主要分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC),其中NSCLC又分為鱗癌(SCC)、腺癌和大細胞癌等，約占肺癌發生率的80%以上[3-4]。外泌體是細胞外囊泡的一個子集，是一種脂質雙分子層包裹的小囊泡，直徑為30～150 nm，密度為1.13～1.21 g/mL,呈球形、扁球形或杯狀結構，存在于血清、尿液、唾液、胸腔積液等多種體液中[5]。研究表明，在NSCLC的微環境中，外泌體miRNA在癌癥和間質細胞之間的轉移已被證明與癌癥的發生和進展有關[6-7]。外泌體通過miRNA在腫瘤細胞間傳遞遺傳信息，從而促進肺癌細胞增殖和轉移[8]。本研究探討血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p在NSCLC中的表達及其診斷價值，旨在了解外泌體miRNA與NSCLC的關系，為NSCLC的早期診斷提供新的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1-12月就診于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院,新確診且未經治療的NSCLC患者179例作為NSCLC組。納入標準：(1)采血前NSCLC患者未采取手術切除和放化療等方法的治療；(2)通過手術切除且病理確診為NSCLC；(3)NSCLC患者無其他系統腫瘤；(4)病歷相關資料記錄完善。另選取在本院體檢中心進行體檢的健康者144例作為健康對照組。納入標準：(1)年齡45周歲以上；(2)影像學及腫瘤標志物檢測均未見明顯異常；(3)無任何腫瘤相關疾病或其他重大疾病。TNM分期參照文獻[9]進行劃分。隨機將收集的NSCLC患者和健康對照者標本分為訓練集和驗證集，兩組臨床數據資料包括年齡、性別、淋巴結是否轉移、腫瘤最大徑和TNM分期比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組訓練集和驗證集的臨床特征比較(n)

1.2儀器與試劑 CFX-96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；ExoQuickTM試劑(美國，SBI公司)；Trizol試劑和總RNA提取試劑(德國，QIAGEN)；逆轉錄試劑盒、miRNA引物和qRT-PCR試劑(美國GeneCopoeia公司)；蛋白質定量試劑盒(美國 Thermo 公司)；鼠抗人 TSG101 蛋白單克隆抗體(英國 Abcam)；兔抗人 CD9 蛋白單克隆抗體：(美國，CST公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔 IgG (美國，CST公司)。

1.3方法

1.3.1實驗設計 通過檢索PubMed數據庫，根據文獻[10]報道來自同源的3個miRNA基因簇，包括miR-17-92、miR-106a-363、miR-106b-25家族編碼的共15個miRNA，因其在NSCLC患者的支氣管肺泡灌洗液中高表達，所以將其作為候選分子。分子成員見表2。

表2 3個miRNA簇的分子成員

1.3.2血清外泌體的提取和鑒定 (1)血清外泌體的提取。加入63 μL ExoQuickTM沉淀劑，加冰4 ℃冰箱放置30 min。4 ℃、1 500 r/min離心30 min。倒掉上清，繼續離心5 min，吸掉上清液。加入50 μL磷酸鹽緩沖液，振蕩吹打混勻將外泌體懸浮。用于下一步RNA的提取、外泌體鑒定或儲存于-80 ℃冰箱待用。(2)透射電子顯微鏡鑒定血清外泌體。首先將待鑒定的血清外泌體樣本分別進行50×和100×稀釋，取15 μL樣本滴于碳膜銅網上，小心夾住銅網，吸附1 min。將銅網置于濾紙上，以吸去多余的樣本。滴入配制好的2%醋酸雙氧鈾染液15 μL進行負染1 min，將銅網放在燈下烘烤10 min進行觀察。(3)納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術。用磷酸鹽緩沖液1∶10 000重懸外泌體，將樣品注射到納米顆粒跟蹤分析儀器中，根據利用光散射和布朗運動的特性對樣本進行粒徑和濃度分析。重復檢測樣本兩次。(4)蛋白質免疫印跡(Western Blot)鑒定外泌體表面標志性蛋白CD9和TSG101將提取好的外泌體及去除外泌體的血清蛋白樣品加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液進行裂解。按照蛋白質定量試劑盒進行蛋白定量。利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，轉至聚偏二氟乙烯膜上后，用新鮮的5%脫脂奶粉封閉。孵育CD9 和TSG101的第一抗體和第二抗體。使用電化學發光法顯色、曝光。

1.3.3提取血清外泌體RNA、逆轉錄和qRT-PCR 根據文獻[11-12]報道，選用miR-16-5p作為血清外泌體中每種miRNA的qRT-PCR內參照。通過克隆測序驗證miRNA特異性擴增產物。qRT-PCR引物序列表3。

表3 qRT-PCR 引物序列

1.3.4常見腫瘤標志物的檢測 血清鱗狀細胞癌抗原(SCCA)通過雅培i1000化學發光儀及其配套試劑檢測；血清癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)通過羅氏Cobas e601全自動電化學發光儀及其配套試劑檢測。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0統計軟件進行數據處理。采用2-ΔΔCt計算每個樣本中每個miRNA分子的相對表達量。非正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示，并采用非參數Mann-WhitneyU檢驗進行統計分析。利用GraphPad Prism 5軟件繪制散點圖;利用MedCalc9.6.4.0軟件繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)、計算曲線下面積(AUC)，計算差異表達的miRNA對NSCLC的診斷效能。利用軟件MATLAB運用Logistic回歸分析建立NSCLC診斷模型。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1鑒定血清外泌體 外泌體經醋酸雙氧鈾水溶液染色后，置于低分辨率透射電鏡下觀察，視野內可見具有囊狀雙層脂質膜結構的圓形顆粒，直徑約為100 nm，見圖1A。Western Blot在提取的血清沉淀物中成功鑒定出外泌體表面標志蛋白CD9、TSG101(見圖1B)，而這兩種外泌體表面標志蛋白在去除沉淀的上清液中呈低表達。通過NTA技術觀察外泌體樣品粒徑大小及顆粒濃度，結果顯示顆粒直徑為30～200 nm占99.5%，分散均一，呈單峰正態分布曲線，峰值約為115.2 nm。以上結果表明，利用此方法可以從血清中分離出完整的外泌體，為下一步研究血清外泌體中的生物標志物提供了基礎保證。

注：A為透射電鏡下外泌體形態； B為Western Blot實驗鑒定表面標志蛋白CD9和TSG101在血清外泌體和去除外泌體的血清上清液中的表達情況。

2.2兩組訓練集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p相對表達量比較 兩組訓練集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p相對表達量比較見表4。ROC曲線分析顯示，miR-17-5p的AUC為0.834(95%CI：0.744 ～0.902)，靈敏度為75.0%，特異度為83.3%。miR-20b-5p的AUC為0.808(95%CI：0.715～0.881)，靈敏度為72.9%,特異度為85.4%。見圖2。

表4 兩組訓練集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p相對表達量比較[M(P25,P75)]

注：A～E依次為NSCLC組訓練集血清外泌體miR-17-5p 、miR-20b-5p、SCCA、CYFRA21-1和CEA對NSCLC診斷的ROC曲線。

2.3兩組驗證集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p相對表達量比較 NSCLC組驗證集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p與健康對照組比較，差異有統計學意義(均P<0.000 1,見表5)。ROC曲線分析顯示，miR-17-5p 的AUC 為0.784(95%CI：0.725～0.836)，靈敏度為71.0%;特異度為75.0%,miR-20b-5p的AUC為0.756(95%CI：0.695～0.810)，靈敏度為68.7%;特異度為75.0%。見圖3。

注：A～E依次為NSCLC組驗證集血清外泌體miR-17-5p 、miR-20b-5p、SCCA、CYFRA21-1和CEA對NSCLC診斷的ROC曲線。

表5 兩組驗證集血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p相對表達量比較[M(P25,P75)]

2.4建立NSCLC血清外泌體miRNA診斷模型及診斷效能 在訓練集中，將NSCLC組篩選的血清外泌體中miR-17-5p和miR-20b-5p和血清SCCA、CYFRA21-1和CEA的相對表達量通過 Matlab 軟件進行Logistic 多元回歸分析，建立NSCLC血清外泌體miRNA診斷模型，公式如下：logit(P)=1.371 3-(0.373 9×miR-17-5p)-(0.175 8×miR-20b-5p)-(0.046 8×CEA)-(0.020 6×CYFRA21-1)-(0.082 1×SCCA)。采用ROC曲線分析建立的模型對NSCLC的診斷效能，其AUC為0.914(95%CI：0.839～0.961)，靈敏度為0.916，特異度為0.833。此模型對NSCLC的診斷效能優于其中任何一個單個分子。將分析得出的NSCLC血清外泌體miRNA診斷模型代入驗證集中進一步驗證其診斷效能。驗證集中診斷模型對NSCLC診斷的AUC為0.824(95%CI：0.768～0.871)，靈敏度為72.5%，特異度為72.9%，顯著高于驗證集中單一分子的AUC。該診斷模型對TNM不同分期的NSCLC患者進行診斷，其對NSCLC 患者TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期診斷的AUC分別為0.783(95%CI：0.710～0.845)、0.832(95%CI：0.760～0.889)和0.902(95%CI：0.835～0.948)。見圖4。

注：A為訓練集的診斷模型ROC，B為驗證集的診斷模型ROC。C、D、E圖分別為診斷模型對非小細胞肺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的診斷效能。

3 討 論

研究者指出，NSCLC初步診斷后，大多數TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者可從手術切除中獲益，而晚期患者多選擇非手術治療，預后較差[13]。目前CT平掃已廣泛用于健康查體中，雖能篩選及早發現肺內小結節，但容易漏檢早期不典型的肺癌，且受到費用高、輻射性等方面制約。因此，尋找更有效的診斷早期NSCLC的生物標志物至關重要。

相對于傳統組織活檢，血清外泌體檢測可重復操作，患者無痛苦，可用作監測病情發展及預后的指標[14]。相對于冗長復雜的超速離心法提取外泌體，本研究采用的聚合物共沉淀分離外泌體，具有較高的提取率，且操作簡便、快捷。沉淀后，這些外泌體可以通過在離心機進行簡單的低速離心進行回收[15]。

本研究運用了透射電子顯微鏡、NTA技術和Western Blot 3種方法驗證利用聚合物共沉淀可以成功提取完整的外泌體。透射電鏡下可見具有囊狀雙層脂質膜結構的圓形顆粒，直徑約為100 nm，具有茶托樣結構的囊泡樣物質。Western Blot在提取的血清沉淀物中成功鑒定出外泌體表面標志蛋白CD9、TSG101，而這兩種外泌體表面標志蛋白在去除沉淀的上清中呈低表達。通過NTA技術觀察外泌體，結果顯示顆粒直徑分布于30～200 nm范圍占99.5%，分散均一，呈單峰正態分布曲線，峰值約為115.2 nm。以上結果表明，利用沉淀法可以從血清中分離出完整的外泌體，為下一步研究血清外泌體中的生物標志物提供了基礎保證。

本研究評估了血清外泌體中miRNA作為診斷NSCLC的生物標志物的潛在應用價值。有研究表明，不同的miRNA表達譜在NSCLC中被鑒定和驗證，miRNA作為肺癌診斷和預后的生物標志物的具有潛在的應用價值[16]。本研究的15個miRNA分子來自同源的3個miRNA簇。大多數的報道都只研究1種miRNA的作用，而對于同源miRNA簇作為分子標志物的研究并不多。已有報道，NSCLC患者的腫瘤組織和血清中miR-17-5p相對表達量較健康對照者高表達[17]，與本研究結果相一致。本研究將篩選出的訓練集中的miR-17-5p和miR-20b-5p兩個分子，聯合CEA、CYFRA21-1和SCCA建立針對NSCLC診斷的新模型，對訓練集和驗證集中NSCLC診斷效能均較高，并且隨著TNM分期的遞增，該診斷模型對TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的診斷效能逐漸增強，AUC逐漸增大。

本研究血清外泌體中miR-17-5p和miR-20b-5p對NSCLC的診斷效能均高于目前臨床開展的蛋白腫瘤標志物(SCCA、CYFRA21-1和CEA)，有發展為臨床應用的診斷NSCLC生物標志物的潛力。對于血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p與臨床病理參數的相關性得出的結論，在后續的研究中將進一步擴大樣本量，驗證其相關性。

本研究miR-17-5p和miR-20b-5p在NSCLC血清外泌體中呈現高表達的趨勢，可能與其研究選取的樣本類型、受試對象的人群特征、所采取的實驗設計方式等不同有關。

綜上所述，本研探討NSCLC患者血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p的表達并分析其臨床診斷價值，發現miR-17-5p和miR-20b-5p是潛在的診斷NSCLC的生物標志物。由血清外泌體miR-17-5p和miR-20b-5p聯合血清SCCA、CYFRA21-1和CEA建立的NSCLC診斷模型，對于NSCLC具有較高的診斷效能，并與TNM分期具有重要的關系，是理想的診斷模型。也為進一步研究其在NSCLC中的作用機制和臨床意義奠定基礎。