流感疫苗脂質(zhì)體的制備方法及粒徑對(duì)免疫原性的影響

劉曉琳，謝青昕，李 漂，張 茜，楊 艾，魯衛(wèi)東

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

脂質(zhì)體（Liposomes）是一種類生物膜結(jié)構(gòu)磷脂雙分子層構(gòu)成的封閉囊泡，兼具佐劑和載體功能[1]。脂質(zhì)體大小從幾十納米到十幾微米，按結(jié)構(gòu)和粒徑的不同可以將其分為小單室脂質(zhì)體（10～200 nm）、大單室脂質(zhì)體（0.2～1 μm）和多室脂質(zhì)體（1～5 μm）[2]。脂質(zhì)體能夠包裹多種分子，如抗原或免疫調(diào)節(jié)化合物，并促進(jìn)將這些物質(zhì)靶向輸送到特定的免疫細(xì)胞[3]。研究表明[4-6]，脂質(zhì)體與抗原單純混合使得抗原免疫原性增強(qiáng)，脂質(zhì)體包裹的抗原免疫原性更強(qiáng)，且可改變免疫應(yīng)答的類型和方式，可同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，明顯優(yōu)于細(xì)胞免疫誘導(dǎo)力差的鋁佐劑，增強(qiáng)體液免疫，抗體滴度升高、免疫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，還可產(chǎn)生免疫記憶。

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法和凍融凍干法制備流感疫苗脂質(zhì)體，通過(guò)比較包封率、粒徑和免疫原性，選擇最佳制備方法；采用最佳制備方法制備流感疫苗脂質(zhì)體凍干粉，篩選出適合的流感疫苗脂質(zhì)體粒徑。

1 材料與方法

1.1 流感疫苗

H1N1（批號(hào)：201910001），血凝素含 量：299 μg/mL；H3N2（批號(hào)：201911001），血凝素含量：282 μg/mL；B（V）（批號(hào)：201911003），血凝素含量：223 μg/mL；B（Y）（批號(hào)：201912005），血凝素含量：147 μg/mL；均由江蘇沃森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)KM 種小鼠，雌性，標(biāo)準(zhǔn)體重（18～22 g），昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)為SCXK9（滇）2005-0008]。

1.3 主要試劑及儀器

大豆卵磷脂（北京美亞斯磷脂技術(shù)公司）、膽固醇（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、Folin-酚蛋白定量試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、特級(jí)胎牛血清（美國(guó)eBioscience公司）、MTT（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）、RDE（Ⅱ）受體破壞酶（Denka），超聲破碎儀（美國(guó)SONICS VCX-150），冷凍干燥機(jī)（美國(guó)LABCONCO 4.5L），低溫超高速離心機(jī)（日本日立，SCP85H），BIO-RAD iMark TM 酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.4 四價(jià)流感疫苗的配制方法

將4 個(gè)單價(jià)的流感疫苗血凝素按比例稀釋：H1N1 稀釋8.31 倍，H3N2 稀釋7.83 倍，B（V）稀釋6.19 倍，B（Y）稀釋4.08 倍，使每個(gè)單價(jià)流感的血凝素含量為36 μg/mL，然后將36 μg/mL 的單價(jià)流感疫苗充分混合形成36 μg/mL 的四價(jià)流感疫苗原液。

1.5 兩種方法制備脂質(zhì)體凍干粉

（1）薄膜分散法：精密稱取膽固醇80 mg 和大豆卵磷脂300 mg 溶于20 mL 無(wú)水乙醇中，完全溶解后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜狀態(tài)，四價(jià)流感疫苗和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）按1.4∶1 混合，得流感疫苗脂質(zhì)體混懸液，0.06 mbar，-52℃下冷凍干燥28 h 即得脂質(zhì)體凍干粉[7]；（2）凍融凍干法：精密稱取膽固醇80 mg 和大豆卵磷脂300 mg 溶于20 mL 無(wú)水乙醇中，完全溶解后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜狀態(tài)后加入PBS 30 mL，50℃水化旋轉(zhuǎn)45 min，間歇超聲（超30 s 停30 s，功率60%），50℃水浴孵育1 h，取出冷至常溫，四價(jià)流感疫苗溶液和脂質(zhì)體混懸液按1.4∶1 混合，-40℃凍融2 次，0.06 mbar，-52℃下冷凍干燥28 h 即得脂質(zhì)體凍干粉[8]。

1.6 粒徑分析

取脂質(zhì)體凍干粉用一定量PBS 充分溶解后取少量滴于載玻片上進(jìn)行顯微觀察，Nano measurer 1.2 軟件對(duì)脂質(zhì)體粒徑進(jìn)行分析。

1.7 包封率的測(cè)定

采用低溫超高速離心法分離脂質(zhì)體與游離藥物，用Lowry 法測(cè)定包封率[9]。

包封率（En%）=總蛋白含量（μg）-游離蛋白含量（μg）/總蛋白含量（μg）×100%

1.8 免疫原性考察

小鼠隨機(jī)分為PBS 陰性對(duì)照組、疫苗原液陽(yáng)性對(duì)照組、凍融凍干法組和薄膜分散法組，每組5 只。（1）細(xì)胞免疫：小鼠免疫7 d，無(wú)菌條件下，取脾臟研磨，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為3.0×106個(gè)/mL。參照文獻(xiàn)[10]采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平，以刺激指數(shù)（SI）評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫；（2）體液免疫：小鼠免疫7 d，取免疫后小鼠血清，參照文獻(xiàn)[11]采用血凝抑制法（HI）測(cè)定血清的抗體滴度，評(píng)價(jià)其體液免疫，免后與免前抗體滴度比≥4 認(rèn)為產(chǎn)生有效體液免疫。

1.9 粒徑對(duì)流感疫苗脂質(zhì)體凍干粉免疫原性影響

制備脂質(zhì)體混懸液，通過(guò)調(diào)整超聲功率和時(shí)間，制備出不同粒徑的脂質(zhì)體，超聲后具體操作步驟同1.2.3。小鼠隨機(jī)分為PBS 陰性對(duì)照組、原液陽(yáng)性對(duì)照組、3.7 μm 組、2.0 μm 組、1.0 μm 組、0.45 μm 組，每組5 只。免疫7 d、14 d、28 d 后通過(guò)MTT 法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖水平[9]評(píng)價(jià)粒徑對(duì)細(xì)胞免疫原性影響；采用血凝抑制法（HI）測(cè)定血清的抗體滴度，探討粒徑對(duì)體液免疫原性的影響。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較選擇單因素方差分析，以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 2 種制備方法脂質(zhì)體的平均粒徑和包封率

薄膜分散法制備（圖1A）的脂質(zhì)體分布不均一，粒徑范圍稍大，凍融凍干法（圖1B）制備的脂質(zhì)體分布均一，且粒徑范圍小；2 種方法制備流感疫苗脂質(zhì)體凍干粉包封率和平均粒徑，見(jiàn)表1。

表1 2 種制備方法脂質(zhì)體的平均粒徑和包封率Tab.1 Average particle size and encapsulation efficiency of liposomes prepared by the two methods

圖1 脂質(zhì)體顯微拍攝圖（×200）Fig.1 Liposome micrograph（×200）

2.2 2 種制備方法脂質(zhì)體的細(xì)胞免疫

小鼠腹腔免疫7 d 后，淋巴細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)單因素方差分析，各免疫組與PBS 陰性組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組與凍融凍干法組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且凍融凍干法組SI 值高于各實(shí)驗(yàn)組，表明凍融凍干法制備的流感疫苗脂質(zhì)體前期能增強(qiáng)細(xì)胞免疫效應(yīng)。

表2 制備方法篩選時(shí)的ConA SI（n=5，）Tab.2 ConA SI during preparation method screening（n=5，）

表2 制備方法篩選時(shí)的ConA SI（n=5，）Tab.2 ConA SI during preparation method screening（n=5，）

與PBS陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與凍融凍干法組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 種制備方法脂質(zhì)體的體液免疫

小鼠腹腔免疫7 d 后，免后與免前的HI 值實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。免疫第7 天，各免疫組的抗體滴度比HI 均≥4，凍融凍干組和薄膜分散組的抗體滴度比大于原液組，且凍融凍干組的抗體滴度比大于薄膜分散組，結(jié)果表明凍融凍干法和薄膜分散法制備的流感疫苗脂質(zhì)體具有良好的免疫原性，且凍融凍干法免疫效果較好。

表3 制備方法篩選時(shí)HI 值（n=5）Tab.3 HI value at the time of preparation method screening（n=5）

2.4 不同粒徑流感疫苗脂質(zhì)體包封率

通過(guò)調(diào)整細(xì)胞破碎儀超聲時(shí)間和功率，顯微觀察，用Nano measurer 1.2 軟件對(duì)脂質(zhì)體粒徑進(jìn)行分析得到平均粒徑為3.7 μm、2.0 μm、1.0 μm、0.45 μm 4 種不同粒徑的脂質(zhì)體，包封率測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 不同粒徑脂質(zhì)體的包封率（%）Tab.4 Encapsulation efficiency of liposomes with different particle sizes

2.5 不同粒徑流感疫苗脂質(zhì)體的細(xì)胞免疫

小鼠免疫7 d、14 d 和28 d 的脾淋巴細(xì)胞增殖能力如表5。在一個(gè)免疫周期內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組和原液組與PBS 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），較大粒徑組（3.7 μm 組和2.0 μm 組）的SI 值高于原液組，且3.7 μm 組SI 值大于2.0 μm 組，與疫苗原液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明粒徑較大的脂質(zhì)體疫苗使脾淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，產(chǎn)生細(xì)胞免疫，且3.7 μm 組產(chǎn)生細(xì)胞免疫更強(qiáng)。

表5 7 d、14 d、28 d 時(shí)ConA SI（n=5，）Tab.5 ConA SI at 7，14，28 d（n=5，）

表5 7 d、14 d、28 d 時(shí)ConA SI（n=5，）Tab.5 ConA SI at 7，14，28 d（n=5，）

與PBS陰性對(duì)照組比較,*P＜0.05，**P＜0.01；與原液組比較,#P＜0.05，##P＜0.01。

2.6 不同粒徑流感疫苗脂質(zhì)體的體液免疫

血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表6 所示。由表5 可知，在一個(gè)免疫周期內(nèi)，各免疫組HI 值均≥4，表明產(chǎn)生有效體液免疫；較大粒徑組（3.7 μm 組和2.0 μm 組）的HI 值明顯高于其他組，且3.7 μm組的HI 值大于2.0 μm 組。結(jié)果表明在一個(gè)免疫周期內(nèi)各免疫組都能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫，且3.7 μm 組產(chǎn)生體液免疫效應(yīng)最強(qiáng)。

表6 7 d、14 d、28 d 時(shí)抗體滴度比（n=5）Tab.6 Antibody titer ratio at 7，14，28 d（n=5）

3 討論

最佳制備方法凍融凍干法制備的脂質(zhì)體流感疫苗包封率為87.48%，脂質(zhì)體粒徑均一。凍融凍干法在反復(fù)凍融的過(guò)程中能包封更多的疫苗，使得包封率增大，免疫效應(yīng)也增強(qiáng)。通過(guò)改變超聲功率和時(shí)間制得平均粒徑為3.7 μm、2.0 μm、1.0 μm 和0.45 μm 4 種不同粒徑脂質(zhì)體，隨著粒徑的減小，包封率也逐漸下降，較大粒徑脂質(zhì)體流感疫苗能產(chǎn)生較好的細(xì)胞和體液免疫，且3.7 μm免疫效果更強(qiáng)。

脂質(zhì)體作為佐劑的流感疫苗能產(chǎn)生良好的免疫原性，且粒徑較大的脂質(zhì)體疫苗產(chǎn)生的免疫較強(qiáng)。研究表明[12-13]，脾臟對(duì)脂質(zhì)體的吸收與巨噬細(xì)胞的吞噬能力有關(guān)，體內(nèi)的吞噬細(xì)胞會(huì)較快的識(shí)別相對(duì)較大的脂質(zhì)體，吞噬能力隨粒徑增大而增強(qiáng)，較大粒徑的脂質(zhì)體疫苗能被網(wǎng)狀吞噬系統(tǒng)快速識(shí)別，攜帶至靶向器官，有利于抗原刺激免疫器官，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫原性。然而，脂質(zhì)體粒徑過(guò)大血管通透性差，導(dǎo)致脂質(zhì)體不能通過(guò)肝血管的細(xì)胞間隙，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬清除，較小粒徑的脂質(zhì)體（180 nm）使藥物的血藥濃度和生物利用度明顯的提高，雖能增加靶部位聚集和延長(zhǎng)半衰期，但易相互聚集融合致抗原滲漏[14-15]。安全性良好，可生物降解，生物相容性好是脂質(zhì)體最大的優(yōu)點(diǎn)，但是脂質(zhì)體穩(wěn)定性差限制它的廣泛運(yùn)用，且目前流感疫苗大多數(shù)為液體制劑，存在穩(wěn)定性差和冷鏈運(yùn)輸壓力等不足，本實(shí)驗(yàn)采用凍融凍干法制備流感疫苗脂質(zhì)體凍干粉，制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，且穩(wěn)定性得到一定改善。