長鏈非編碼RNA-p21 調控微小RNA-9/去乙酰化酶1 信號通路逆轉結直腸癌細胞奧沙利鉑耐藥性

張麗菊 ，姜曉明 ，陳昌賢 ，吳 喜 ，張振勇 ，劉為軍

（1）云南大學醫學院，云南 昆明 650091；2）云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院肛腸科，云南 昆明 650032；3）昆明理工大學醫學院，云南 昆明 650031）

結直腸癌（colorectal cancer,CRC）是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，到目前為止，在制定臨床治療方案時尚未能實現依據 CRC 的分子特征進行個體化治療。藥物治療是CRC 目前主要的治療手段。然而，耐藥性的產生大大限制了其治療效果。化療藥物奧沙利鉑（oxalipl atin，OXA）屬于第三代鉑類化合物，已廣泛用于進展期 CRC 的治療。然而，在 CRC 化療過程中，腫瘤藥物抵抗影響了奧沙利鉑對CRC 的治療效果和預后，患者結局并不理想[1-2]。因此，改善奧沙利鉑的化療耐藥對改善結直腸癌的預后具有重要的臨床意義。

目前，有多種關于 CRC 細胞產生奧沙利鉑耐藥機制的研究，自噬是研究熱點之一[3-4]。細胞自噬可通過多途徑改善結直腸癌[5]等腫瘤細胞對奧沙利鉑的化療耐藥。長鏈非編碼 RNA（long non－coding RNA，lncRNA）是指長度在大于200nt 的轉錄本，它們不參與編碼蛋白，卻參與多種重要的生物學調控過程。LncRNA-p21 是一個長鏈基因間非編碼 RNA，被認為是 p53 直接轉錄的靶基因[6]，在多種癌癥中發揮重要作用，是一個有潛在價值的癌癥治療靶點[7]。有研究表明LncRNA-p21 與 miR-9 相互作用[8]，且 miR-9 能夠影響細胞自噬過程[9]，但這一過程的具體機制并不十分明確。本研究擬在細胞水平探討 CRC中LncRNA-p21 參與奧沙利鉑影響細胞自噬的過程及可能機制，并進一步分析LncRNA-p21 調控微小RNA-9（micro RNA-9,miR-9)/去乙酰化酶1（SIRT1）信號通路對結直腸癌細胞奧沙利鉑耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

研究時間為2017 年1 月至2019 年12 月。人結直腸癌細胞株HCT116、SW620 均購買自美國的典型菌種保藏中心公司。美國禮來公司采購LncRNA-p21 蛋白、miR-9 蛋白、SIRT1 蛋白。自美國皮卡斯生物技術購買核酸提取試劑盒和Western 試劑盒。自美國西格瑪公司購買奧沙利鉑抑制劑和自噬抑制劑3-MA（3-methyladenosine）。微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）I/II 抗體來自美國Novus 公司；p62 抗體來自美國圣克魯斯生物技術。轉染試劑 Lipofectamine 2000 購自美國Life Technologies 公司；自日本TaKaRa 公司購買逆轉錄試劑盒；自武漢華美生物工程有限公司購買CCK-8 試劑盒；自美國Hyclone 生物有限公司購買RPMI-1 640 培養基及胎牛血清。

1.2 細胞培養

將結直腸腫瘤細胞置入含10% 胎牛血清的RPMI-1 640 培養基中（含2 mmoL/L 谷氨酰胺，100 U/mL 鏈霉素，100 U/mL 青霉素），在恒溫培養箱中（37℃、5% CO2）培養48～72 h。取對數生長期細胞用于實驗，細胞均活力良好。

1.3 細胞轉染

取對數生長期腫瘤細胞，細胞活力良好，用胰酶消化后接種到6 孔板中，觀察細胞密度達60% 左右時，使用轉染試劑 Lipofectamine 2000分別將對照組 shRNA（sh-NC）、敲降 LncRNAp21 的 siRNA（si-LncRNA-p21）對 CRC 細胞株SW620、HCT116 進行轉染，實驗嚴格按照操作說明和流程進行操作。

1.4 蛋白質印跡法（Western blotting）

將細胞培養皿置于冰上，裂解細胞使用放射免疫沉淀試驗裂解液，收集細胞然后提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度使用BCA 法。按照20 μg/孔蛋白樣品量，將蛋白依次加入到聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中，待電泳結束后取目的蛋白條帶轉膜，用5%脫脂奶封閉，隨后加入相應一抗（按1∶1 000比例配制），4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗（按1∶2 000 比例配制），放置室溫孵育2 h，化學發光液顯色用增強型化學發光試劑，凝膠成像儀上曝光顯影。

1.5 細胞活性檢測

用胰酶消化各組對數生長期的細胞并使用完全培養基將細胞密度稀釋為 1×105/mL。使用96孔板接種細胞，接種量 0.1 mL/孔，每孔加入100 μL 完全培養基。分別在 24 h、48 h、72 h、96 h 后更換新鮮培養基。

采用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活性。檢測時，每孔加入 20 μL CCK-8 試劑，孵育 2 h。然后使用ReadMax 酶標儀（波長450 nm）檢測各孔細胞的吸光值。細胞增殖能力與吸光值成正相關。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）

檢測mRNA 水平用RT-qPCR 法。提取各組細胞中總RNA 使用TRIzol 試劑盒，紫外可見分光光度計檢測各組細胞中總RNA 濃度，然后取1 μg RNA 樣品逆轉錄制備cDNA。設置反應體系參照試劑盒說明書，進行RT-qPCR 檢測各樣本中SIRT1 表達，（正向引物：5′ -TATGGCAAAA GCGGACAAGG-3′，反向引物：5′ -CTTCGCAACA TCACCAATGGA-3′），以β-肌動蛋白（β-actin）為內參。采用2-ΔΔCt法進行定量。

1.7 克隆形成實驗檢測CRC 細胞的增值活力

將對數生長期的CRC 細胞用無鈣鎂離子平衡鹽溶液洗滌 2 次，然后用 DMEM 培養液（含有10% 胎牛血清）將細胞密度調整至 1×106/L。在6 孔板中使用終濃度為 1.5 μg/mL 的 MBP 或 MBPHTA 刺激并培養細胞（每孔2 mL）。使用等體積培養液作為陰性對照。經37 ℃，5% CO2培養箱培養 2 周后，將細胞用 4% 多聚甲醛固定10 min，然后用 0.05% 結晶紫染色 30 min，去離子水緩慢沖洗至 6 孔板無雜色，放置室溫干燥。顯微鏡下計數細胞克隆，細胞數大于50 計數為1 個克隆。每組蛋白設 3 個復孔，計算克隆形成率。公式：克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.8 統計學處理

應用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。用兩樣本t檢驗比較2 組計量資料的差異；采用簡單相關性分析檢測克隆形成實驗中CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA-p21 在奧沙利鉑耐藥的 CRC 細胞HCT116，SW620 中高表達

通過 qPCR 檢測奧沙利鉑耐藥細胞 HCT116-res 和 SW620-res，與正常 HCT116 和SW620 中LncRNA-p21 表達情況，發現 LncRNA-p21 在奧沙利鉑耐藥細胞HCT116-res 和 SW620-res 中高表達（圖1）。

圖1 LncRNA-p21 在奧沙利鉑耐藥的 CRC 細胞HCT116，SW620 中高表達Fig.1 LncRNA-p21 was highly expressed in OXaliplatin resistant CRC cells HCT116 and SW620

2.2 敲降 LncRNA-p21 抑制細胞自噬，改善HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療抵抗

通過細胞轉染的方式敲降 HCT116 細胞中LncRNA-p21，其敲降 效率通 過qPCR 檢 測（圖2A）。在敲降 LncRNA-p21 以及對照 HCT116細胞中檢測自噬特異性分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，自噬底物 P62，發現 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表達上調（圖2B），說明 LncRNA-p21 能夠影響HCT116 細胞的自噬過程。為了進一步研究LncRNA-p21 對 HTC116 細胞化療耐藥的影響，將敲降 LncRNA-p21 的HCT116 細胞以及對照HCT116 細胞使用奧沙利鉑處理后，檢測克隆形成情況，發現敲降 LncRNA-p21 能夠改善HCT116 對奧沙利鉑的化療抵抗（圖2C）。

圖2 敲降 LncRNA-p21 能夠提高 HCT116 對奧沙利鉑的化療敏感性Fig.2 Knockdown lncrNA-P21 can increase the chemosensitivity of HCT116 to oxaliplatin.

2.3 敲降 LncRNA-p21 影響 miR-9 的表達

為了探究 LncRNA-p21 對 miR-9 的影響，通過qPCR 檢測敲降 LncRNA-p21 的 HCT116 細胞中 miR-9 的表達情況，發現敲降LncRNA-p21能夠上調 miR-9 的表達（圖3A），說明 LncRNAp21 可能是通過 miR-9 參與 HCT116 細胞化療敏感性調控。

圖3 敲降 LncRNA-p21 影響 miR-9 的表達Fig.3 Knockdown of lncRNA-P21 affected the expression of Mir-9

2.4 過表達 miR-9 改善 HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療抵抗

通過細胞轉染的方式在 HCT116 細胞中過表達 miR-9，使用 qPCR 檢測轉染效率（圖4A）。在過表達miR-9 的細胞中檢測自噬特異性分子 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，自噬底物 P62，發現 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62 表達上調（圖4B），說明 miR-9 參與 HCT116 細胞自噬過程的調控。此外，在過表達 miR-9 的 HCT116 細胞中使用奧沙利鉑處理后檢測克隆形成，發現過表達 miR-9 改善了HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療敏感性（圖4C）。

圖4 過表達 miR-9 的增強 HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療敏感性Fig.4 Overexpression of miR-9 enhances the chemosensitivity of HCT116 cells to oxaliplatin

2.5 SIRT1 的表達受到 LncRNA-p21 和 miR-9的調控

SIRT1 作為一個重要的分子，不僅參與細胞自噬的調控，還能夠受到 miR-9 的影響。為了驗證 LncRNA-p21 和 miR-9 對 SIRT1 的影響，通過WB 分別檢測 SIRT 在敲降 LncRNA-p21 和過表達miR-9 的 HCT116 細胞中的表達。結果表明，敲降 LncRNA-p21 或者過表達miR-9 能夠抑制 miR-9 的表達（圖5A～B）。

圖5 SIRT1 的表達受到 LncRNA-p21 和 miR-9 的調控Fig.5 The expression of SIRT1 is regulated by lncRNAP21 and miR-9

3 討論

結直腸癌嚴重威脅人類的健康，對其分子機制的深入研究是提高我們對疾病認識、攻克疾病的必然要求。奧沙利鉑是CRC 患者化療的一線用藥，其應用顯著改善了結直腸癌患者的總生存期和緩解率[10]。但 OXA 的作用機制目前仍未完全清楚。其基本機制為奧沙利鉑在細胞核內與 DNA結合形成的 DNA 加合物，導致 DNA 鏈內、鏈間交聯、雙鏈斷裂等損傷，進而導致細胞因 DNA的轉錄、復制阻斷而誘發其凋亡[9,11]。自噬在腫瘤發生和治療過程中起著雙刃劍的作用 ADDIN EN.CITE[12]，細胞自噬水平是影響腫瘤細胞對奧沙利鉑化療抵抗的重要因素，可通過保護結直腸癌細胞干性增強結直腸癌細胞對奧沙利鉑的化療抵抗[5]。

大量相關研究表明，LncRNA 可通過多種途徑調節細胞自噬，介導腫瘤耐藥，促進結直腸腫瘤的進展[13-14]。本研究結果也表明，LncRNAp21 在奧沙利鉑耐藥的 CRC 細胞 HCT116，SW620 中高表達，而敲降 LncRNA-p21 可抑制細胞自噬，改善 HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療抵抗。有研究發現，LncRNA-p21 通過抑制βcatenin 信號通路進而減緩結腸癌干細胞的Warburg 效應進程[15]。本研究進一步發現，敲降LncRNA-p21 影響 miR-9 的表達，而過表達 miR-9 可改善 HCT116 細胞對奧沙利鉑的化療抵抗。研究還發現SIRT1 的表達受到 LncRNA-p21 和miR-9 的調控。基于以上研究，筆者已經清楚，LncRNA-p21 在奧沙利鉑耐藥的結直腸腫瘤細胞中表達顯著上調，抑制 LncRNA-p21 表達可以提高 CRC 對奧沙利鉑的敏感性；在抑制 LncRNAp21 表達的 CRC 細胞中，miR-9 表達水平升高而SIRT1 表達降低，同時自噬特異性分子 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，自噬底物 P62 升高。因此筆者提出假說：LncRNA-p21 通過 miR-9 調控SIRT 的活性，進而影響 SIRT 介導的細胞自噬，最終調控 CRC 對OXA 的化療抵抗性。本研究為在分子層面探討腫瘤發生發展的機制提供了良好的啟示，同時為耐藥性結直腸癌的治療提供新的標志物和靶點。對于是否有進一步腫瘤細胞內信號通路的激活以及 LncRNA-p21，miR-9 及SIRT1 的功能尚有待進一步研究，該假說尚需通過體內實驗來證實。