非編碼RNA 在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

郭方圓 ，李文亮 ，徐 凡 ，魏向群

（1）云南大學附屬醫院婦科，云南 昆明 650021；2）昆明醫科大學第三附屬醫院婦瘤科，云南 昆明 650118）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是婦科常見的惡性腫瘤。根據國際癌癥研究署2020 年全球癌癥統計數據表明，在女性惡性腫瘤中，子宮頸癌發病率和死亡率居全球女性癌癥第四位，其全球新發病例大約有60.4 萬[1]，僅中國子宮頸癌新發病例數就有10.97 萬例[2]，占全球宮頸癌新發病例的18.1%。嚴重威脅著女性的健康及生命。雖然隨著宮頸癌疫苗及宮頸癌篩查的普及，宮頸癌晚期檢出率在逐年下降，但不發達國家宮頸癌的3～5 a 生存率不高于50%[3]。因此，尋找合適的分子標志物用于宮頸癌的早期診斷及治療極為重要。

lncRNA 為長度大于200 個核苷酸，且不編碼蛋白質的轉錄物。在宮頸癌發生發展機制研究中，lncRNA 發揮的作用，包括早期腫瘤標志物檢測[4]、腫瘤發生發展過程中增殖和凋亡能力改變[5]、化藥耐藥[6]和放射性抵抗[7]等日益凸顯，為臨床早期診斷、治療和預后評估奠定了理論基礎。人類LINC00982 基因是位于染色體1p36.32 上的一個非編碼 RNA，通過NCBI 數據庫檢索顯示LINC00982有2 個剪切體，剪切體1 為3 722 bp，剪切體2為658 bp。目前關于LINC00982 的研究較少，現有的報道證實其在胃癌、肺腺癌及腎癌等惡性腫瘤中呈現低表達狀態，扮演著類似抑癌基因的作用，通過誘導細胞凋亡，從而抑制癌細胞增殖和腫瘤生長。但目前尚無LINC00982 在宮頸癌方面的相關報道。miRNA 是一類長約22 個核苷酸的非編碼RNA，可通過完全或者不完全互補的方式結合到靶基因的3’-UTR（非編碼區），從而起到降解或者抑制靶基因翻譯的作用，從而調節細胞的分化、生長、凋亡和增殖。miRNA 可通過多種信號途徑參與多種實體腫瘤細胞的增殖、侵襲、黏附、轉移以及凋亡，而且與放療、化療、靶向治療等密切相關。hsa-miR-1246 是被具有抗癌活性的 P53 所調控的一個新的 miRNA，定位于人胞核染色體2q31.1。hsa-miR-1246 調控著癌細胞的增殖、分化、凋亡、衰老及轉移入侵，在包括宮頸癌在內的多種腫瘤的診斷、靶基因治療和判斷預后方面發揮著重要作用。相關研究表明，hsa-miR-1246 可促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移[6]。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選取云南大學附屬醫院婦科2021 年1 月至2021 年10 月經子宮頸活檢確診為子宮頸癌的患者樣本43 例（根據2019 年FIGO 分期標準，Ⅰ期15 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期11 例、Ⅳ期4 例，其中宮頸鱗癌38 例、腺癌5 例；低中分化30 例，高分化13 例），患者年齡（56.57±8.04）歲。同時選取同期因子宮肌瘤等良性疾病行全子宮切除后病理確診為正常宮頸樣本21 例作為對照組，患者年齡（44.70±3.99）歲。宮頸癌患者入組標準：（1）病理確診為宮頸癌，且根據國際婦產科聯合會（FIGO）2019 分期標準進行分期；（2）所有宮頸癌患者取材前未接受放化療，免疫治療；（3）臨床資料齊全。正常宮頸組納入標準：（1）因其他良險疾病行子宮全切的患者；（2）HPV 檢測為陰性；（3）病理證實為正常宮頸組織。排除標準：除外其他惡性腫瘤、血液病及凝血功能障礙者。采集以上患者標本均簽署知情同意書，研究方案經云南大學附屬醫院醫學倫理委員會同意（倫理審查編號2021044）。

1.2 試劑及材料

Trizol Reagent 購自美 國MRC 公 司、RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 購自Thermo Scientific?公司、All-in-One? qPCR Mix及All-in-One? miRNA qRT-PCR Detection Kit 購自GeneCopoeia?公司、lncRNA 及microRNA 引物由GeneCopoeia?合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列Tab.1 The sequence of RT-PCR primers

1.3 Total RNA 提取

取液氮保存的組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按照100 mg 左右組織加入1 mL Trizol，震蕩后靜置5 min，加入200 μL 氯仿，震蕩數分鐘后靜置5 min，12 500 r/min、4℃、離心15 min。離心后將上層水相吸出400 μL，震蕩混勻后靜置數分鐘，12 500 r/min，4℃、離心15 min。棄上清，加入1 mL 無水乙醇，7 500 r/min，4℃、離心5 min，棄上清，洗滌2 次。適度干燥，加入50 μL 去酶水反復吹打數次，使其充分溶解待用。

1.4 Real-time PCR 檢測

對提取的總RNA 進行反轉錄獲得cDNA，采用SYBR Green 法進行RT-qPCR 驗證，分別以GAPDH、U6 為內參基因。RT-qPCR 反應體系為20 μL：Water 7.0 μL、Primer 2.0 μL、cDNA 1.0 μL、2×PCR Master Mix 10.0 μL。反應條件為：95℃、10 min；（95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、10 s）×40 cycles；（65℃、60 s，95℃、15 s）；30℃、30 s。RT-qPCR 檢測中每孔均設3 個復孔，取平均Ct值作為該樣本的最終Ct 值。分別以GAPDH、U6為內參基因，以2-△△Ct 值作為LINC00982 及miR-1246 的相對表達水平。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 正常子宮頸和子宮頸癌組織中LINC00982-1/2（LINC00982 轉錄形成2 個剪切體，剪切體1 及剪切體2）及hsa-miR-1 246 的表達變化

如表2 所示，與正常子宮頸組織相比，人子宮頸癌組織中LINC00982-1/2 的表達下調（P＜0.05），見圖1；而hsa-miR-1 246 表達上調（P＜0.05），見圖2。

圖1 LINC00982 剪切體1 及LINC00982 剪切體2 在正常子宮頸及子宮頸癌組織中的表達情況Fig.1 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2in normal cervical and cervical carcinoma

圖2 hsa-miR-1 246 在正常宮頸及子宮頸癌組織中的表達情況Fig.2 expression of hsa-miR-1 246 in normal cervical and cervical carcinoma

表2 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.2 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表2 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.2 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05。

2.2 正常子宮頸及子宮頸癌組織不同分化程度（病檢確定分化程度）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表達變化

如表3 所示，與正常子宮頸組織相比，中低分化及高分化宮頸癌組織中LINC00982-1/2 的表達均下調（P＜0.05），且高分化宮頸癌組織中的表達量低于中低分化宮頸癌組織（P＜0.05），見圖3；與正常子宮頸組織相比，中低分化及高分化宮頸癌組織中hsa-miR-1 246 表達均上調（P＜0.05），且高分化宮頸癌組織中的表達量低于中低分化宮頸癌組織（P＜0.05），見圖4。

圖3 LINC00982 剪切體1 和LINC00982 剪切體2 在人正常宮頸及不同分化程度的宮頸癌組織中的表達變化Fig.3 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervical and cervical cancer tissues with different degrees of differentiation

圖4 hsa-miR-1246 在人正常宮頸及不同分化程度的宮頸癌組織中的表達變化Fig.4 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervical and cervical cancer tissues with different degrees of differentiation.

表3 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.3 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表3 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.3 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05；與低、中分化組比較，#P＜0.05。

2.3 正常子宮頸及子宮頸癌組織不同分期（以2019 年FIGO 分期為標準）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1 246 的表達變化

如表4 所示，Ⅲ/Ⅳ期人宮頸癌組織中LINC 00982-1/2 的表達高于Ⅰ/Ⅱ期人宮頸癌組織（P＜0.05），Ⅰ/Ⅱ期人宮頸癌組織中LINC00982-1/2的表達均低于正常宮頸組織，而Ⅲ/Ⅳ期中LINC00982-1 的表達量高于正常子宮頸組織，LINC00982-2 的表達量則低于正常子宮頸組織，見圖5；Ⅲ/Ⅳ期人宮頸癌組織中hsa-miR-1246的表達高于Ⅰ/Ⅱ期人宮頸癌組織，且Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期人宮頸癌組織中hsa-miR-1246 的表達均高于正常人宮頸組織（P＜0.05），見圖6。

圖5 LINC00982 剪切體1 和LINC00982 剪切體2 在人正常宮頸及不同分期的宮頸癌組織中的表達變化Fig.5 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervix and cervical cancer tissues of different stages

圖6 hsa-miR-1246 在人正常宮頸及不同分期的宮頸癌組織中的表達變化Fig.6 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervix and cervical cancer tissues of different stages.

表4 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.4 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表4 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.4 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05；與Ⅰ/Ⅱ期比較，#P＜0.05。

2.4 正常子宮頸及子宮頸癌組織不同病理類型中LINC00982-1/2、hsa-miR-1 246 的表達變化

如表5 所示，與正常人宮頸組織相比，人宮頸鱗狀細胞癌（SSC）及腺癌（ADS）中LINC00982-1/2 的表達均下調，具有顯著性差異（P＜0.05），且腺癌中LINC00982-1 的表達量低于鱗狀細胞癌（P＜0.05），腺癌中LINC00982-2 的表達量則高于鱗狀細胞癌，但兩者間無統計學意義（P＞0.05），見圖7；與正常人宮頸組織相比，人宮頸鱗狀細胞癌及腺癌中hsa-miR-1246 的表達均上調，具有顯著性差異（P＜0.05），且腺癌中hsa-miR-1246 的表達量高于鱗狀細胞癌（P＜0.05），見圖8。

圖7 LINC00982 剪切體1 和剪切體2 在正常子宮頸及子宮頸癌組織不同病理類型中的表達變化Fig.7 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in different pathological types of normal cervix and cervical cancer tissues.

圖8 hsa-miR-1246 在正常子宮頸及子宮頸癌組織不同病理類型中的表達變化Fig.8 expression of hsa-miR-1246 in different pathological types of normal cervix and cervical cancer tissues.

表5 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.5 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表5 LINC00982、hsa-miR-1246 表達量（）Tab.5 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05；與鱗狀細胞癌組比較，#P＜0.05。

2.5 正常人子宮頸及子宮頸癌組織不同SCCA 表達 量（＜1.5 ng/mL 和≥1.5 ng/mL）中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表達變化

如表6 所示，與正常人宮頸組織相比，在人宮頸癌組織SCCA（＜1.5 ng/mL）及SCCA（≥1.5 ng/mL）中LINC00982-1/2 的表達均下調（P＜0.05），且隨SCCA 的增高，LINC00982-1/2 的表達量降低，見圖9；而hsa-miR-1246 表達上調（P＜0.05），且隨SCCA 的增高，其表達量增高，見圖10。

圖9 LINC00982 剪切體1 和LINC00982 剪切體2 在正常人子宮頸及子宮頸癌組織不同SCCA 表達量Fig.9 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in normal cervix and cervical cancer tissues with different SCCA levels

圖10 hsa-miR-1246 在正常人子宮頸及子宮頸癌組織不同SCCA 表達量Fig.10 Expression of hsa-miR-1246 in normal cervix and cervical cancer tissues with different SCCA levels

表6 LINC00982、has-miR-1246 表達量（）Tab.6 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表6 LINC00982、has-miR-1246 表達量（）Tab.6 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05；與SCCA（＜1.5 ng/mL）組比較，#P＜0.05。

2.6 正常人子宮頸及子宮頸癌不同腫瘤大小中LINC00982-1/2、hsa-miR-1246 的表達變化

如表7 所示，與正常人宮頸組織相比，腫瘤直 徑≤4 cm 及腫瘤直徑＞4 cm 的組織 中，LINC00982-1/2 的表達均下調，具有顯著性差異（P＜0.05），腫瘤直 徑＞4 cm 的組織 中，LINC00982-1/2 的表達高于腫瘤直徑≤4 cm 者，見圖11；與正常人宮頸組織相比，腫瘤直徑≤4 cm 及腫瘤直徑＞4 cm 的組織中，hsa-miR-1246 的表達均上調，具有顯著性差異（P＜0.05），腫瘤直徑＞4 cm 的組織中，hsa-miR-1246 的表達高于腫瘤直徑≤4 cm 者，見圖12。

圖11 LINC00982 剪切體1 和LINC00982 剪切體2 在正常人子宮頸及子宮頸癌不同腫瘤大小中的表達變化Fig.11 Expression of LINC00982-1 and LINC00982-2 in the normal cervix and different tumor sizes of cervical cancer

圖12 hsa-miR-1246 在正常人子宮頸及子宮頸癌不同腫瘤大小中的表達變化Fig.12 Expression of hsa-miR-1246 in the normal cervix and different tumor sizes of cervical cancer.

表7 LINC00982、has-miR-1246 表達量（）Tab.7 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

表7 LINC00982、has-miR-1246 表達量（）Tab.7 Expression levels of LINC00982 and hsa-miR-1246（）

與正常宮頸組比較，*P＜0.05；與≤4 cm頸腫瘤組織組比較，#P＜0.05。

3 討論

3.1 LINC00982 在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

lncRNA 作為非編碼RNA，其二級結構與蛋白質和染色質相互作用，使其具有廣泛功能。大量通過檢測lncRNA 的表達水平差異，來判斷其與宮頸癌的關聯。人類LINC00982 基因是一個長的基因間非編碼RNA。對其相關研究較少。目前對其相關機制研究表明，LINC00982 可以通過調節P15 和P16 蛋白的表達來部分抑制癌細胞的增殖并阻止細胞周期[8]，同時LINC00982 還可以通過PI3K-ATK 信號通路，誘導細胞凋亡[9-10]，扮演著類似抑癌基因的作用。但尚未見LINC00982在宮頸癌中的相關報道。

本研究發現，與正常子宮頸組織相比，子宮頸癌組織中LINC00982-1/2 的表達下調，提示LINC00982 可能在宮頸癌組織中發揮抑癌基因的作用。且LINC00982 的表達與宮頸癌組織的分化程度、臨床分期、病理類型、SCCA 的高低、腫瘤直徑密切相關。宮頸癌組織中LINC00982 的表達量隨SCCA 的增高而降低，進一步表明LINC00982 的表達可能與腫瘤負荷相關，提示其可能扮演著類似抑癌基因的角色。但患者臨床分期越晚、腫瘤直徑越大、分化程度越低，宮頸癌組織中LINC00982 的表達量越高，似乎又與其抑癌基因的功能相悖，這一現象的出現一方面可能與臨床樣本的檢測會受到多種干擾因素影響相關。另一方面，可能與實驗樣本中晚期樣本數量偏少有關（Ⅳ期患者僅4 例），需要后期擴大實驗樣本量進行驗證，或進一步通過細胞實驗進行腫瘤細胞表型分析驗證。腺癌中LINC00982-1 的表達量低于鱗狀細胞癌，但腺癌與鱗狀細胞癌中LINC00982-2 兩者比較差異無統計學意義，雖然兩者間無統計學意義，但導致這種差異的原因是否與LINC00982 不同剪接體間的功能不同有關，仍有待后續進一步深入研究。

3.2 hsa-miR-1 246 在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

目前，人體內已發現的miRNA 有2000 多種，占人類基因組的1%，調控著 30%基因的表達[11]。部分腫瘤相關 miRNA 負載量的高低可作為患者預后的獨立危險因素，從而可預測腫瘤的發生及治療效果[12]。研究表明，子宮頸癌患者血清樣品[13]、癌組織[14]中 miR-1246 呈高表達，同時，宮頸鱗癌患者血清中 hsa-miR-1246 含量明顯高于宮頸上皮內瘤變患者及健康體檢婦女，且 hsa-miR-1246 的高表達與宮頸鱗癌患者 FIGO 分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、脈管浸潤密切相關[15]。

本研究發現，與正常子宮頸組織相比，子宮頸癌組織中hsa-miR-1246 高表達，提示hsa-miR-1246 可能在宮頸癌組織中發揮癌基因的作用。且hsa-miR-1246 的表達與宮頸癌組織的分化程度、臨床分期、SCCA 的高低、腫瘤直徑密切相關。患者臨床分期越晚、腫瘤直徑越大、SCCA 表達量越高、分化越低，hsa-miR-1246 的表達量越高，進一步表明hsa-miR-1246 可能促進腫瘤的發生與發展，與患者預后不良密切相關。且hsa-miR-1246 的表達與病理類型密切相關，在腺癌中的表達量明顯高于鱗狀細胞癌。

本文首次報道了宮頸癌相關的一種LncRNA（LINC00982），該 LncRNA 在宮頸癌組織中表達下調，提示其可能參與宮頸癌的發生與發展，為宮頸癌的診斷提供新的生物標志物及治療提供潛在而有效的靶點。同時我們發現，hsa-miR-1246在子宮頸癌組織中高表達，且hsa-miR-1246 的表達與宮頸癌組織的分化程度、臨床分期、SCCA 的高低、腫瘤直徑密切相關，表明hsa-miR-1246 可能作為癌基因，參與腫瘤的發生與發展。此外，LINC00982 與miR-1246 的表達呈負相關，表明LINC00982 可能通過靶向hsa-miR-1246 參與腫瘤的發生、發展過程，其機制有待進一步深入研究。