藏紅花素通過Nrf2/HO-1通路減輕大鼠肺缺血再灌注損傷的實驗研究*

石俊杰 寧改麗 石一民

（河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056000）

肺缺血再灌注（LIR）損傷常繼發(fā)于肺溶栓、肺袖狀切除術(shù)、肺移植手術(shù)等治療過程，是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的重要因素。LIR損傷是非常復(fù)雜的病理生理過程，其中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用[1]。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（Nrf2/HO-1）是氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，并且能夠調(diào)控核因子-κB（NF-κB）表達(dá)與活化參與炎癥反應(yīng)過程[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)激活Nrf2/HO-1通路能夠明顯減輕大鼠LIR 損傷[4]。

藏紅花屬于鳶尾科番紅花屬球莖草本植物，其干燥柱頭為名貴中藥材，具有活血化瘀、涼血解毒、散郁開結(jié)等功效，常用于憂思郁結(jié)、胸膈痞悶、產(chǎn)后瘀血腹痛等癥的治療[5]。藏紅花素為中藥藏紅花的主要活性成分之一，是一種罕見的水溶性類胡蘿卜素，具有良好的抗氧化、抗炎活性[6]。有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素能夠激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡而減輕三氧化二砷所致心臟損傷[7]。本研究旨在探討藏紅花素對大鼠LIR損傷的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只清潔級健康雄性SD大鼠，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2018-004，8周齡，體質(zhì)量220～260 g。清潔環(huán)境飼養(yǎng)：室溫23～25℃、相對濕度50%～60%、晝夜明暗交替。本研究獲得邯鄲市第一醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 藏紅花素購自美國Sigma公司；Brusatol（Nrf2抑制劑）購自美國MCE公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒購自美國R&D公司；Nrf2、HO-1抗體購自北京博奧森生物科技有限公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗體購自美國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.3 實驗儀器 DH-150型動物呼吸機（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Premier 3000型血氣分析儀（美國GEM公司）；DU640型分光光度計（美國Beckman公司）；HM355S型石蠟切片機、1410101型酶標(biāo)儀、UVP型凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司）；Power-Pac型電泳儀（美國BioRad公司）、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）。

1.4 分組與給藥 按隨機數(shù)字表法將80只大鼠分為4組：假手術(shù)組、模型組、藏紅花素組、藏紅花素+Brusatol組，各20只。造模前30 min，藏紅花素組15 mg/kg腹腔注射[8]，藏紅花素+Brusatol組予藏紅花素 15 mg/kg、Brusatol 2 mg/kg腹腔注射[9]，假手術(shù)組和模型組腹腔注射生理鹽水，各組給藥體積均為5 mL/kg。

1.5 模型制備 除假手術(shù)組外，其他組均參照文獻(xiàn)[10]制備LIR大鼠模型。麻醉后取仰臥位，切開氣管并插管，連接動物呼吸機（呼吸頻率70次/min，呼吸比2∶1，潮氣量10 mL/kg），500 U/kg尾靜脈注射肝素鈉，左側(cè)第5肋間開胸，夾閉左肺門使左肺缺血，左肺不再膨脹、由淡紅色變?yōu)榘底霞t色，表明阻斷成功。1 h后松開動脈夾，左肺逐漸膨脹、暗紫紅色逐漸恢復(fù)淡紅色，表明再灌注成功。假手術(shù)組行相同的手術(shù)通路，但不阻斷左肺門。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）動脈血氧分壓（PaO2）、氧合指數(shù)（OI）檢測：再灌注24 h后，各組隨機取10只大鼠，經(jīng)股動脈取血2 mL，通過血氣分析儀檢測PaO2，OI=PaO2/吸入氧濃度（本實驗吸入空氣，氧濃度為0.21）。2）肺組織病理學(xué)改變及病理評分：麻醉后頸椎脫臼處死，開胸取左肺組織，切取約1 cm3組織塊，置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，行石蠟包埋、5 μm厚度切片、HE染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)改變。分別從肺水腫、肺泡及間質(zhì)區(qū)炎癥、出血、肺不張、透明膜形成共5個方面進(jìn)行病理評分[11]：400倍光學(xué)顯微鏡下，視野內(nèi)未見病變記0分，病變面積占視野＜25%記1分、25%～50%記2分、50%～75%記3分、＞75%記4分，5個方面評分之和即為病理評分。3）肺組織SOD、CAT、MPO活性和MDA含量：取左肺組織100 mg，研磨勻漿后，4℃、3 000 r/min離心5 min取上清液，通過分光光度計檢測SOD、CAT、MPO活性和MDA含量。4）ELISA法檢測肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β水平：再灌注24 h后，取各組剩余的10只大鼠，麻醉后氣管插管，采用注射器向氣管內(nèi)緩慢注入3 mL磷酸鹽緩沖液行肺泡灌洗后抽回灌洗液，共灌洗3次，4℃、3 000 r/min離心10 min取上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測TNF-α、IL-1β 水平。5）肺組織 Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測：頸椎脫臼處死，開胸取左肺組織100 mg，剪碎后加入4℃裂解液、冰上靜置30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min取上清液，BCA法測定蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)PDVF膜、室溫封閉 1.5 h后，加 Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗體4℃孵育12 h，洗膜后加IgG二抗室溫孵育1 h，ECL顯影并通過Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，多組間比較行單因素方差分析，方差齊時兩組間比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett′s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動脈血PaO2、OI水平及肺組織病理評分比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組動脈血PaO2、OI降低（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組PaO2、OI升高（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組PaO2、OI降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠動脈血PaO2、OI及肺組織病理評分的比較（±s）

表1 各組大鼠動脈血PaO2、OI及肺組織病理評分的比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與藏紅花素組比較，△P＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組別n PaO2（mmHg）OI 病理評分（分）假手術(shù)組模型組藏紅花素組藏紅花素+Brusatol組10 10 10 10 87.25±11.94 54.08±9.13*82.76±11.42#62.35±10.67△414.96±35.72 259.14±30.27*392.57±36.08#297.43±33.59△0.50±0.10 16.20±2.30*4.30±0.60#14.50±2.10△

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變及病理評分的比較 見圖1，表1。假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡未見滲液，間質(zhì)區(qū)未見水腫及炎性細(xì)胞浸潤；模型組可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡破裂融合、有滲液，間質(zhì)區(qū)水腫、炎性細(xì)胞大量浸潤等病理學(xué)改變；與模型組比較，藏紅花素組肺組織上述病理學(xué)改變明顯減輕；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組肺泡破裂滲液、間質(zhì)區(qū)水腫及炎性浸潤等病理學(xué)改變明顯加重。與假手術(shù)組比較，模型組肺組織病理評分升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組病理評分降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組病理評分升高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠肺組織SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組SOD、CAT活性降低，MPO活性和MDA含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組SOD、CAT活性升高，MPO活性和MDA含量降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組SOD、CAT活性降低，MPO活性和MDA含量升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織SOD、CAT、MPO活性和MDA含量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組藏紅花素組藏紅花素+Brusatol組n 10 10 10 10 SOD（U/mg）107.53±12.68 62.95±8.41*98.16±12.07#71.48±9.15△CAT（U/mg）79.56±10.24 43.27±6.09*71.52±9.83#50.46±7.24△MPO（U/mg）6.15±0.87 11.48±1.53*6.49±0.91#10.36±1.64△MDA（nmol/mg）3.92±0.46 7.64±1.15*4.59±0.63#6.68±1.02△

2.4 各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平比較（ng/L，±s）

組 別n TNF-αIL-1β假手術(shù)組模型組藏紅花素組藏紅花素+Brusatol組10 10 10 10 74.95±13.06 186.73±25.41*90.48±16.72#151.36±23.94△113.84±15.29 307.24±48.63*153.92±20.71#260.85±39.13△

2.5 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較 見圖2，表4。與假手術(shù)組比較，模型組肺組織Nrf2、HO-1表達(dá)量降低，p-NF-κB p65表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組Nrf2、HO-1表達(dá)量升高，p-NF-κB p65表達(dá)量和 p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素+Brusatol組 Nrf2、HO-1表達(dá)量降低，p-NF-κB p65表達(dá)量和 p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組藏紅花素組藏紅花素+Brusatol組n 10 10 10 10 Nrf2 1.07±0.12 0.14±0.03*0.95±0.11#0.28±0.05△HO-1 0.82±0.11 0.13±0.02*0.57±0.08#0.21±0.04△NF-κBp65 0.65±0.09 0.68±0.10*0.62±0.08#0.67±0.09△p-NF-κBp65 0.04±0.01 0.48±0.07*0.09±0.02#0.37±0.05△p-NF-κBp65/NF-κBp65 0.06±0.02 0.71±0.14*0.15±0.03#0.56±0.09△

3 討論

肺臟是機體血流高灌注器官之一，對缺血及再灌注損傷非常敏感，防治LIR損傷一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點。夾閉左肺門45～60 min制備的LIR大鼠模型與人類臨床病理相似，是普遍認(rèn)可的LIR動物模型制備方法。本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素預(yù)處理能夠明顯提高LIR大鼠動脈血PaO2、OI水平，改善肺組織病變并降低病理評分，提示藏紅花素能夠減輕LIR大鼠肺組織損傷、改善LIR大鼠肺功能。

組織缺血及再灌注過程線粒體呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)茏琛ⅫS嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)換成黃嘌呤氧化酶增多等導(dǎo)致ROS大量生成，超過SOD、CAT等組成的內(nèi)源性抗氧化酶體系的抗氧化能力，導(dǎo)致ROS不能及時被清除而攻擊生物膜、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，造成氧化應(yīng)激損傷[12]。LIR導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集并釋放炎癥因子，其中TNF-α、IL-1β除了能夠誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)外，還能趨化中性粒細(xì)胞等進(jìn)一步釋放炎癥因子而加重炎癥反應(yīng)。MPO屬于血紅素過氧化物酶超家族成員，能夠催化生成氧化劑而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，并且MPO能夠間接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集而加重炎癥反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素預(yù)處理能夠明顯提高LIR大鼠肺組織SOD、CAT活性并降低MPO活性、MDA含量，降低肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β水平，提示藏紅花素能夠抑制LIR大鼠肺組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

正常生理狀態(tài)下，定位于細(xì)胞質(zhì)中的抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2與Keap1形成復(fù)合物而無活性。氧化應(yīng)激損傷等病理性刺激能夠促進(jìn)“Nrf2-Keap1”解離，游離狀態(tài)Nrf2核轉(zhuǎn)位后與抗氧化反應(yīng)元件序列結(jié)合，誘導(dǎo)SOD、CAT等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高ROS清除能力[14]。HO-1是Nrf2的下游信號蛋白，能夠催化血紅素降解，其降解產(chǎn)物膽綠素具有較強的抗氧化活性，是內(nèi)源性抗氧化劑[15]。NF-κB是一種由p50/p65二聚體形成的核轉(zhuǎn)錄因子，組織缺血再灌注等病理狀態(tài)能夠誘導(dǎo)NF-κB磷酸化而活化，核轉(zhuǎn)位后p-NF-κB p65亞基能夠與特異性位點結(jié)合而誘導(dǎo)炎性因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)。盧曉郎等[16]發(fā)現(xiàn)HO-1能夠抑制NF-κB活化與核轉(zhuǎn)位。本研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素預(yù)處理能夠明顯提高LIR大鼠肺組織Nrf2、HO-1表達(dá)量，降低p-NF-κB p65表達(dá)量，降低p-NF-κB p65/NF-κB p65比值；Nrf2抑制劑Brusatol能夠明顯逆轉(zhuǎn)藏紅花素對LIR大鼠肺組織Nrf2、HO-1、p-NF-κB p65表達(dá)的調(diào)控作用以及對肺組織損傷的保護(hù)作用；提示藏紅花素對LIR大鼠肺組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用，可能與其激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB活化有關(guān)。

綜上所述，藏紅花素能夠抑制LIR大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕LIR損傷，改善肺功能，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB活化有關(guān)。LIR損傷病理機制復(fù)雜，本課題組將進(jìn)一步探討藏紅花素對LIR損傷的作用機制。