一株黃顙魚源嗜水氣單胞菌的分離、鑒定及特性分析

黃 維 韋慕蘭 蒙蘭麗 韋日鋒

（1.田東縣水產(chǎn)技術推廣站，廣西 田東 531500；2.都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術推廣站，廣西 都安 530700）

0 引言

黃顙魚，俗稱黃蜂魚、黃鼓魚、黃角丁等，隸屬于鲇形目鲿科黃顙魚屬小型底層經(jīng)濟魚類，主要分布于河道、湖泊、水庫等靜水或緩流水域。其因具有含肉率高、肌肉粗脂肪含量適宜、肉質(zhì)鮮嫩細膩、富含多種人體必需氨基酸等優(yōu)點而深受人們喜愛。2018 年，黃顙魚在我國淡水養(yǎng)殖魚類中占比已達1.65%，產(chǎn)量為48 萬t。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的持續(xù)擴大和養(yǎng)殖密度的不斷增加，黃顙魚病害形勢日趨嚴峻。其中，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、銅綠假單胞菌等致病菌頻繁引起的黃顙魚細菌性疾病暴發(fā)尤為顯著，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失的同時，嚴重制約了黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

2021 年8 月，廣西壯族自治區(qū)百色市田東縣某黃顙魚養(yǎng)殖場出現(xiàn)暴發(fā)性疾病，患病魚呈現(xiàn)腹部腫大、腹腔積水、肛門紅腫等癥狀。筆者從患病黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟組織中分離到一株優(yōu)勢菌，對分離菌株進行綜合鑒定，并對該菌株致病性和藥物敏感性進行系統(tǒng)分析，旨在為該病的科學防治提供數(shù)據(jù)支撐和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

患病黃顙魚取自田東縣某黃顙魚養(yǎng)殖場。人工感染試驗用健康黃顙魚購自田東縣農(nóng)貿(mào)市場，規(guī)格為12 ～15 cm，實驗室暫養(yǎng)3 ～5 d 無發(fā)病死亡現(xiàn)象。血瓊脂培養(yǎng)基、微生物微量生化鑒定管購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自北京陸橋技術有限責任公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 病原菌分離與純化

將無菌接種針刺入但不穿透發(fā)病黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟組織，劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基，置于 30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h；用無菌接種針挑取單菌落于血瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學觀察

將純化后的菌株于血瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線接種，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察單菌落形態(tài)學特征和菌落周邊溶血環(huán)特征。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，置于顯微鏡下觀察革蘭氏染色結果和菌體形態(tài)特征。

1.4 生化特性分析

對分離菌株的代表性生化特性使用微生物微量生化鑒定管進行測定，比照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應細菌生化特性指標初步鑒定分離菌株。

1.5 分子生物學鑒定

將分離菌株接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 下恒溫培養(yǎng)24 h。PCR 模板使用新鮮菌液經(jīng)離心去除培養(yǎng)基后所剩菌體，用細菌通用性引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）對分離菌的16S rDNA 進行擴增。采用50 μL 反應體系：PCR 預混酶（2×Taq PCR Master Mix，含DNA 聚合酶、dNTP 與緩沖液）25 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，雙蒸水 19 μL，DNA 模板2 μL。擴增反應程序為預變性溫度94 ℃，預變性時間5 min；變性溫度94 ℃，變性時間30 s，退火溫度55 ℃，退火時間30 s，延展溫度72 ℃，延展時間1 min，循環(huán)次數(shù)30 次；穩(wěn)定溫度72 ℃，穩(wěn)定時間10 min。使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化回收，由上海立菲生物技術公司測序，Blast 分析測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有核酸序列同源程度，采用Neighbor-Joining 法使用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 藥物敏感試驗

取100 μL 純化培養(yǎng)24 h 后的新鮮菌液，于血瓊脂平板上均勻涂布，待血瓊脂培養(yǎng)基表面基本干燥后，將藥敏紙片分別粘貼于血瓊脂培養(yǎng)基上，倒置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。觀察抑菌圈的形成情況并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑與藥物敏感性間的相互關系，確定分離菌株對各藥敏紙片所對應藥物的敏感程度。

1.7 人工感染試驗

將分離菌株接種在BHI液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，12 000 r/min 離心2 min 沉淀菌體，去上清液，用0.85%無菌生理鹽水洗滌收集，采用麥氏比濁法和梯度稀釋法制備成1×10、1×10、1×10、1×10CFU/mL 的菌懸液。將健康黃顙魚分為4 個感染組和1 個陰性對照組，每組30 尾。分別用4 種不同濃度的菌液對4 個感染組進行腹腔注射，每尾黃顙魚從腹鰭基部等量注射0.1 mL，用無菌生理鹽水（0.85%）對對照組黃顙魚每尾等量注射0.1 mL。期間常規(guī)飼養(yǎng)管理，對7 d 內(nèi)各組黃顙魚的死亡情況及時進行觀察、記錄，并立即解剖死亡魚，從肝臟、腎臟、脾臟組織中再次進行菌株分離與鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)

將采取到的菌株命名為TDX07，其在血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落周圍有明顯的β 溶血環(huán)，形態(tài)為圓形、乳白色、不透明、有光澤、中間凸起及邊緣光滑。培養(yǎng)24 h 后，菌落直徑1.5 ～2.3 mm。革蘭氏染色呈陰性，短桿菌，長度1 ～2 μm，多數(shù)呈單個或分散排列，少數(shù)成對或呈短鏈狀排列（見圖1）。

圖1 菌株TDX07 的顯微形態(tài)

2.2 生化特性測定

菌株TDX07 的生理生化特性測定結果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中嗜水氣單胞菌標準株的特性一致（見表1）。

2.3 分子生物學鑒定

菌株TDX07 的16S rDNA 序列PCR 擴增產(chǎn)物測序結果為1 537 bp。BLAST 分析顯示，其與嗜水氣單胞菌的16S rDNA 序列（GenBank 登錄號：M59148.1和NR07484.1）具有高度同源性。系統(tǒng)進化樹如圖2 所示，菌株TDX07 與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）聚為一類。

2.4 人工感染試驗

如表2 所示，菌株濃度1×10CFU/mL 感染組，黃顙魚急性快速死亡，1 d 死亡率100.0%；菌株濃度1×10CFU/mL 感染組，黃顙魚第1 天開始死亡， 7 d 死亡率90.0%；菌株濃度1×10CFU/mL 感染組，黃顙魚第1 天開始死亡，7 d 死亡率53.3%；菌株濃度1×10CFU/mL 感染組，黃顙魚第2 天開始死亡，7 d死亡率33.3%；對照組黃顙魚無死亡現(xiàn)象。多數(shù)瀕死黃顙魚表現(xiàn)出腹部腫大、腹腔積水、肛門紅腫、腸道充血、運動失衡及行動遲緩等癥狀，與自然條件下發(fā)病黃顙魚癥狀相同。從瀕死黃顙魚內(nèi)臟組織中分離純化出的細菌性狀與TDX07 一致，經(jīng)鑒定同為嗜水氣單胞菌。

表1 TDX07 的生化特性

圖2 基于16S rDNA 構建的TDX07 系統(tǒng)進化樹

表2 人工感染試驗結果

2.5 藥物敏感試驗

如表3 所示，菌株TDX07 對氨曲南、頭孢唑啉、氧氟沙星等13種藥物敏感，對鏈霉素、妥布霉素中介，對氨芐西林耐藥。

3 討論

菌株TDX07 的生化特性與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中嗜水氣單胞菌標準株的生化特性一致。經(jīng)分子生物學分析，菌株TDX07 的16S rDNA 序列高度同源于美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中嗜水氣單胞菌的16S rDNA 序列。據(jù)此，鑒定TDX07為嗜水氣單胞菌。人工感染試驗證實TDX07 對黃顙魚具有致病性，且菌液濃度越高致病性越強。由此確定，該研究中黃顙魚暴發(fā)性疾病的病原菌為嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌可以產(chǎn)生腸毒素、溶血素、壞死毒素等多種外毒素，除黃顙魚外，還可感染黑天鵝、大羚羊等多種動物，甚至可以感染人類，是典型的魚、禽、畜、人共患病病原菌。因此，養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中應加強嗜水氣單胞菌防控工作。如發(fā)現(xiàn)患病黃顙魚，要立即采用隔離、掩埋等方式進行無害化處理，防止傳染給同水域健康黃顙魚或周邊家禽、家畜，更應避免流入銷售市場。

表3 藥物敏感試驗結果

藥物敏感試驗結果顯示，嗜水氣單胞菌對氨芐西林高度耐藥性。這是因為氣單胞菌屬細菌會產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。氨芐西林屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，β-內(nèi)酰胺酶可使β-內(nèi)酰胺類抗生素失去活性，造成嗜水氣單胞菌對氨芐西林具有天然耐藥性。因此，對于嗜水氣單胞菌感染引起的各類疾病，均應避免使用此類藥物。

近年來，面對黃顙魚細菌性疾病，養(yǎng)殖戶往往盲目使用多種抗生素應對。這種做法易造成黃顙魚養(yǎng)殖水體及周邊環(huán)境中藥物敏感菌株被持續(xù)消滅，進而可能導致由于基因突變等原因形成的耐藥菌株乃至多重耐藥菌株出現(xiàn)并快速增殖。如果此種致病菌感染黃顙魚，將難以使用常規(guī)藥物治愈，甚至有可能出現(xiàn)無藥可醫(yī)的情況。因此，養(yǎng)殖戶面對黃顙魚細菌性疾病時，應第一時間進行藥物敏感試驗，并根據(jù)試驗結果合理選用病原菌敏感性強的藥物進行治療，同時嚴格控制藥物用量，杜絕過量 用藥。