褪黑素調控NLRP3/caspase-1通路減輕脂多糖誘導的人肺泡上皮細胞損傷

王齊 羅松 李亮

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種嚴重肺部炎癥性疾病，其病理特征主要為肺泡上皮細胞損傷，其病情進展迅速，死亡率高達30%～40%，是重癥監護室患者死亡最主要的原因之一，目前尚無確切療效的治療藥物，因此，尋找ALI的治療藥物、研究其作用機制對改善ALI患者的預后具有重要意義[1,2]。褪黑素是一種內源性神經激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理學作用，可參與調控多種炎癥性疾病[3]。研究顯示，褪黑素可減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷，但是褪黑素對減輕ALI的具體作用機制尚不清楚[4]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體是一種蛋白質復合物，可激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，形成NLRP3/caspase-1信號通路，該通路的激活參與ALI的炎性反應[5]。但是，目前NLRP3/caspase-1信號通路在褪黑素對LPS誘導的A549細胞中的作用尚不清楚。因此，本研究通過觀察褪黑素對LPS誘導的A549細胞凋亡及NLRP3/caspase-1通路的影響，初步探索褪黑素對LPS誘導的A549細胞損傷機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人肺泡上皮細胞(A549)購自中科院上海細胞庫，褪黑素、噻唑藍(MTT)試劑盒、LPS購自美國Sigma公司；MCC950購自美國MedChem Express公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物科技有限公司；NLRP3、caspase-1及內參GAPDH引物由上海生工生物工程科技有限公司設計與合成；人腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒購自美國Elabscience公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、RIPA裂解液、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人NLRP3、caspase-1和鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組:常規復蘇A549細胞后，接種在含體積分數10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基培養，每隔2～3 d換液傳代培養，收集對數生長期細胞，將A549細胞隨機分成對照組、LPS組、LPS+褪黑素組(LPS+MT組)、LPS+抑制劑組，其中LPS組使用10 mg/L LPS誘導12 h；LPS+MT組使用800 μmol/L褪黑素預處理4 h，10 mg/L LPS誘導12 h；LPS+抑制劑組使用10 μmol/L MCC950預處理30 min，10 mg/L LPS誘導12 h。本實驗中褪黑素、LPS使用濃度分別參照文獻[6,7]中所用濃度。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖活性:將處理后的各組A549細胞，制備成4×105個/ml的單細胞懸液，以每孔200 μl接種于96孔板中，培養24 h，每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h后，再加入150 μl的DMSO，于酶標儀波長490 nm處測定各孔光密度(OD)值。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期與細胞凋亡:取各組處理后的A549細胞，使用AnnexinV binding buffer將細胞調整成2×105個/ml的細胞懸液，每孔加入PI染液和RnaseA，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。另取各組細胞分別加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI溶液，混勻后，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平:取處理后的各組細胞培養上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 RT-qPCR實驗檢測細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA水平:采用RT-qPCR檢測各組細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達量。Trizol試劑提取各組細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA后，進行RT-qPCR擴增。NLRP3上游引物序列(5’-3’)：CGTGAG

TCCCATTAAGATGGT，下游引物序列(5’-3’)：CCCGA

CAGTGGATATAGAACAGA；caspase-1上游引物序列(5’-3’)：ACAAGGCACGGGACCTATG，下游引物序列(5’-3’)：TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG；GAPDH上游引物序列(5’-3’)：AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游引物序列(5’-3’)：CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達量。

1.2.6 Western blot法檢測細胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達:提取各組A549細胞總蛋白，取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜，使用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗人NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)和鼠抗人β-actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，PBST緩沖液洗膜3次，再對應加入HRP標記的IgG(1∶2 000)二抗，室溫孵育2 h，洗膜顯色，凝膠成像儀中成像，以β-actin為內參，采用Image J軟件分析各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 褪黑素對LPS誘導的A549細胞增殖活性的影響 與對照組比較，LPS組A549細胞OD值顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+MT組與LPS+抑制劑組細胞OD值明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 褪黑素對LPS誘導的A549細胞增殖活性的影響

2.2 褪黑素對LPS誘導的A549細胞周期的影響 與對照組比較，LPS組A549細胞G0/G1期比例顯著升高，S期、G2/M期比例降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+MT組與LPS+抑制劑組細胞G0/G1期比例顯著降低，S期、G2/M期比例升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

對照組LPS組LPS+MT組LPS+抑制劑組

表2 褪黑素對LPS誘導的A549細胞周期的影響

2.3 褪黑素對LPS誘導的A549細胞凋亡的影響 與對照組比較，LPS組A549細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而LPS+MT組和LPS+抑制劑組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與LPS組比較，LPS+MT組與LPS+抑制劑組細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表3。

對照組LPS組LPS+MT組LPS+抑制劑組

表3 褪黑素對LPS誘導的A549細胞凋亡的影響

2.4 褪黑素對LPS誘導的A549細胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響 與對照組比較，LPS組A549細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+MT組與LPS+抑制劑組A549細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 褪黑素對LPS誘導的A549細胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響

2.5 褪黑素對LPS誘導的A549細胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達的影響 與對照組比較，LPS組A549細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+MT組與LPS+抑制劑組細胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 4組A549細胞NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達

圖3 4組A549細胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達情況；A 對照組；B LPS組；C LPS+MT組；D LPS+抑制劑組

3 討論

褪黑素是由松果體分泌的神經內分泌激素，具有抗炎、抗氧化、增強免疫、抗腫瘤活性，在保護神經損傷、肺損傷、血管內皮損傷等方面發揮重要作用[8,9]。Ding等[6]研究表明，褪黑素可通過PI3K/GSK-3β軸上調Nrf2，抑制LPS誘導的人肺泡上皮細胞形態改變和細胞上皮間質轉化，并減少活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平，進而保護人肺泡上皮細胞免受氧化應激損傷。關信民等[10]研究表明，褪黑素可通過激活Akt/mTOR通路減輕同型半胱氨酸(Hcy)誘導的冠狀動脈內皮細胞損傷。本研究結果顯示，LPS誘導的A549細胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例顯著降低，G0/G1期比例、細胞凋亡率明顯升高；而進一步使用800μM褪黑素處理細胞后，A549細胞增殖活性、S期比例、G2/M期比例升高，G0/G1期比例、凋亡率顯著降低，表明褪黑素可顯著抑制LPS誘導的A549凋亡，并促進其增殖。馬一聞等[11]研究表明，褪黑素通過抑制JAK-STATs信號通路，明顯抑制神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶脫氫物(MPP+)誘導小鼠嗜鉻細胞瘤細胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A的表達。另有研究顯示，在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，褪黑激素可通過減少促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和增加抗炎細胞因子IL-4、IL-10水平來減輕神經性炎癥[12]。本研究結果顯示，LPS誘導的A549細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，而進一步使用800 μmol/L褪黑素處理后，細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，表明褪黑素可抑制LPS誘導的A549細胞炎性因子的釋放，減輕LPS所致A549細胞炎癥損傷。但是褪黑素對減輕LPS誘導的A549細胞損傷的作用機制尚不清楚。

NLRP3炎性小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和caspase-1組成，活化的NLRP3炎性小體可激活pro-Caspase-1產生有活性的caspase-1，形成NLRP3/caspase-1信號通路，通過多種信號激活從而產生炎性因子IL-1β和IL-18，擴大炎性反應，導致組織損傷，研究表明，NLRP3/caspase-1信號通路在腫瘤、炎癥性疾病、呼吸系統等疾病中發揮重要的調控作用[13,14]。劉瑞蓮等[15]研究表明，利多卡因通過抑制P2X7R/NLRP3/caspase-1信號通路，減輕ALI大鼠的肺水腫程度，改善肺組織病理損傷程度，降低炎性因子水平。白鑫宇等[16]研究發現，在卵清蛋白所致的支氣管哮喘小鼠模型中，加味五味石膏湯可通過調節Th1/TH2免疫失衡及抑制NLRP3/caspase-1信號通路對支氣管哮喘起治療作用。王棟等[17]研究表明，腦心通可通過抑制NLRP3/Caspase-1通路而顯著抑制LPS誘導的小膠質細胞焦亡。以上研究表明，抑制NLRP3/Caspase-1通路可減輕炎性反應對組織和細胞造成的損傷。本研究發現，使用LPS誘導后的A549細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高，提示LPS可能激活NLRP3/caspase-1信號通路；進一步使用褪黑素或NLRP3抑制劑處理以后，細胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低，提示褪黑素與NLRP3抑制劑的作用效果類似，褪黑素可能通過抑制NLRP3/caspase-1信號通路，減輕LPS誘導的A549細胞損傷。

綜上所述，褪黑素可能通過抑制NLRP3/caspase-1信號通路，抑制LPS誘導的A549細胞炎癥損傷。但本研究局限于NLRP3/caspase-1信號通路相關因子，未對炎癥通路進行全面驗證，仍需做進一步研究。