鹽酸氨溴索基于AE-IPF TGF-β1/smads信號通路對大鼠氣管黏膜的保護作用

樂文俊 梁新梅

特發性肺纖維化急性加重(acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis，AE-IPF)在特發性間質性肺炎中是一種常見的疾病，其發病原因較為復雜，且具有慢性、進行性及不可逆性發展，又被稱為致死性肺疾病[1]。而支氣管癌、肺栓塞是導致特發性肺間質纖維化患者主要的死亡原因[2]。有研究表明，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是造成肺纖維化主要細胞因子，是纖維化進展及產生的主要原因之一[3]。同時TGF-β1下游果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白家族(Smads)信號通路對大鼠肺纖維化進展影響較大[4]。鹽酸氨溴索具有刺激肺泡Ⅱ型上皮細胞合成的作用，同時能夠分泌肺表面活性物質，可促進上皮纖毛的再生，使纖毛功能的恢復，從而維持氣管黏膜的分泌功能[5]。本文旨在研究鹽酸氨溴索基于AE-IPF TGF-β1/smads信號通路對大鼠氣管黏膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取50只SPF級健康成年雄性大鼠，鼠齡7～9周，體重260～280 g，均由華南農業大學提供，生產許可：SCXK(粵)2019-0048。所有大鼠飼養在溫度：20～24℃，相對濕度：60%，換氣次數：10～15次/h，晝夜明暗交替時間：12/12 h，自由活動及飲食。

1.2 方法

1.2.1 AE-IPF模型建立：50只大鼠中隨機選取10只為正常組，其余40只參考臧凝子等[6]報道的AE-IPF模型建立方法，具體操作：采用0.3 ml/100 g劑量的10%水合氯醛在大鼠腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥的方式放在鼠板上，固定大鼠的頭與四肢且使其頸部暴露完全。使用剪刀剔除大鼠頸部毛發，并且采用碘伏對大鼠進行常規消毒，使用手術剪將大鼠頸部皮膚縱向剪開1 cm，隨后采用鑷子和止血鉗逐層剝離大鼠的皮下組織，將大鼠氣管暴露。根據大鼠的體重以0.2 ml/100 g的劑量，對實驗大鼠氣管內注入10 mg/ml博來霉素注射液，注射完畢后，左手直立持固定大鼠的鼠板且右手輕輕按住大鼠的身體，緩慢傾斜，左右搖晃3 min左右，使博來霉素迅速擴散到實驗大鼠肺內，建造AE-IPF模型。

1.2.2 分組：造模成功后，隨機分為模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組，每組10只。次日，分別將鹽酸氨溴索(鹽酸氨溴索注射液，天津藥物研究院藥業有限責任公司，批準文號：國藥準字H20041473)10、20、40 mg/kg對鹽酸氨溴索低、中、高劑量組大鼠進行注射，隨后對正常組和模型組大鼠注射等體積的0.9%氯化鈉溶液，對各組大鼠均干預14 d。

1.2.3 病理學觀察：所有大鼠麻醉后進行脫頸處死，隨后剖取大鼠氣管組織，采用3%的戊二醛和10%甲醛固定24 h，將其垂直在氣道上進行取材，隨后采用磷酸緩沖液進行沖洗，剪取氣管后1/3腹側段，經鋨酸沖洗、固定、醋酸異戊酯置換及乙醇脫水、石蠟包埋后，制作5 μm氣管組織進行HE染色。

1.2.4 支氣管黏膜受損面積、平滑肌厚度：采用JSM-6510型掃描電鏡(上海百賀儀器科技有限公司)對氣管組織進行拍照，觀察并記錄支氣管黏膜超微結構變化，采用Image-pro Plus 6，0圖像分析系統計算支氣管黏膜受損面積及大鼠支氣管平滑肌厚度。

1.2.5 MMP-2、TIMP-1表達水平檢測：采集大鼠右肺組織20 mg，加入210 μl 0.9%氯化鈉溶液后，低溫勻漿1 min進行離心，分離2次后，提取出上層勻漿液備用。采用ELISA法檢測基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP-2)、組織金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitorof metallo proteinase-1，TIMP-1)水平：采用碳酸鹽包被緩沖液稀釋標本，在聚苯乙烯板的反應孔中分別加入0.2 ml標本，5℃處理24 h，甩去孔內液體，浸泡2 min；加入0.2 ml稀釋好的抗體，37℃處理24 h，隨后加陰性和陽性對照血清；加入0.2 ml稀釋的酶標抗體，37℃處理0.5 h；加入0.2 ml臨時配制的TMB底物溶液，37℃處理15 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml終止液，放置在白色的背景下，陽性程度越強，顏色就越深，陰性為極淺或無色，顏色深淺以“+”、“-”來表示。

1.2.6 ZO-1、MRP1、TGF-β1、smads蛋白檢測：取出大鼠右肺組織，采用細胞裂解液進行裂解，在4℃環境下進行離心處理，提取出上清液。采用Western-blotting法對緊密連接蛋白(Zonula occludens-1，ZO-1)、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、TGF-β1、smads蛋白水平進行檢測，將緩沖溶液加入到組織裂解提取液中，在95℃下對其進行5 min滅活，對蛋白質采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行分離，在印跡膜上放入電泳分離出的蛋白質，在室溫中，將其放置到含量為5%的脫脂奶粉中進行封閉，2 h后，將相應蛋白以1∶500稀釋后的一抗抗體和PVDF膜進行孵育；處理24 h，采用PBST洗滌液進行清洗，在室溫下將1∶2 000稀釋后的二抗抗體進行孵育；避光處理30 min，采用PBST洗滌液進行清洗，將PVDF膜和ELC增強的顯色底物共同放置，1 min后，采用X射線對其進行曝光顯影處理，應用Bio-Rad image分析系統對顯影后圖片進行查看，內部基準電壓測量采用肌動蛋白抗體作為對照，重復實驗4次并且進行系統性的分析，以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 5組大鼠氣管組織病理學觀察 正常組大鼠氣管黏膜及氣管平滑肌厚度正常；與正常組相比，模型組大鼠氣管黏膜受損面積明顯增加，氣管平滑肌厚度加大；與模型組相比，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組大鼠氣管黏膜受損面積明顯減輕，氣管平滑肌厚度減少，其中鹽酸氨溴索高劑量組大鼠效果最為明顯。見圖1。

正常組模型組鹽酸氨溴索低劑量組鹽酸氨溴索中劑量組鹽酸氨溴索高劑量組

2.2 5組大鼠氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組支氣管平滑肌厚度增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度比較

2.3 5組大鼠MMP-2、TIMP-1水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組MMP-2、TIMP-1水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組MMP-2、TIMP-1蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠MMP-2、TIMP-1水平比較

2.4 5組大鼠ZO-1、MRP1蛋白水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組ZO-1、MRP1蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 5組大鼠ZO-1、MRPA蛋白比較

2.5 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較 與正常組比較，模型組、鹽酸氨溴索低、中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 5組大鼠ZO-1、MRPA蛋白水平比較(WB圖);A 模型組；B 鹽酸氨溴索低劑量組；C 鹽酸氨溴索中劑量組；D 鹽酸氨溴索高劑量組；E 正常組

與模型組比較，鹽酸氨溴索低、中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索低劑量組比較，鹽酸氨溴索中、高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸氨溴索中劑量組比較，鹽酸氨溴索高劑量組TGF-β1、smads蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較

圖3 5組大鼠TGF-β1、smads蛋白水平比較(WB圖);A 模型組；B 鹽酸氨溴索低劑量組；C 鹽酸氨溴索中劑量組；D 鹽酸氨溴索高劑量組；E 正常組

3 討論

AE-IPF是一種纖維化性間質性肺炎的疾病，臨床表現主要有頑固性干咳、發紺、勞力性呼吸困難，其作用機制不明確，是目前急需解決肺系疑難病癥之一[7]。AE-IPF主要由于多因素造成的肺間質性疾病，其病理特征主要為細胞外基質沉積、成纖維細胞增殖、肺間質炎性細胞浸潤、肺泡結構紊亂，導致大鼠出現肺功能發生進行性降低或呼吸衰竭[3,8]。

近年來，隨著大氣污染及環境惡化等，AE-IPF發病率呈現逐年升高，嚴重威脅人們的生命安全[9]。肺最基本的功能是呼吸，而空氣中許多的異物顆粒及微生物會隨著氣體交換進出機體的呼吸道，呼吸系統與外界接觸是最為頻繁的，其中氣管黏膜纖毛系統是呼吸系統最為重要的一道防御屏障[10]。本文研究顯示，鹽酸氨溴索能夠減少AE-IPF大鼠支氣管黏膜受損面積、支氣管平滑肌厚度，有效改善大鼠呼吸功能，其中高濃度作用明顯。其作用機制可能為：鹽酸氨溴索主要是一種黏液溶解劑，其具有促進肺表面活性物質的合成、抗氧化、抗炎的作用，同時還具有與抗生素協同作用，防止肺不張及肺泡萎陷，進而協助無纖毛區痰液的運送，使黏膜纖毛的運動加速，維持上呼吸道自凈的功效，阻礙有害因素的損傷，從而改善氣管黏膜的正常分泌[11,12]。

目前有大量的研究發現，蛋白酶/抗蛋白酶的失衡以及蛋白酶活性增強是肺纖維化性主要發病因素[13]。MMP-2是一種彈性基質分解活性的酶類，具有降解肺泡壁的纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白多糖、彈性纖維、膠原纖維等細胞外基質成分[14]。TIMPs是一種MMPs的內源性天然抑制因子，其與MMPs結合具有抑制其活性的作用，而TIMP-1在活性中是最強的一種，能夠使細胞外基質沉積并抑制其降解，其是一種氣道纖維化的標志，從而能夠反映出氣道修復重塑的過程[15]。本文研究發現，鹽酸氨溴索能夠降低AE-IPF大鼠MMP-2、TIMP-1水平，從而有效改善大鼠氣道損傷，其中高濃度改善作用顯著。

MRP1在肺支氣管上皮中具有較強的表達，其主要作用于內源性代謝產物，可調節細胞內毒物、藥物以及代謝產物濃度的作用，其主要通過作用于內源性代謝物，能夠調節肺組織氧化應激，進而減少異物對機體損傷的作用[16]。此外，上皮連接功能喪失或者減弱是氣道上皮損傷的主要原因之一，而ZO-1在上皮屏障功能中是一種重要細胞間連接蛋白，其能夠構成緊密連接蛋白復合物，其在肺纖維化大鼠中表達下調[17]。本文研究表明，鹽酸氨溴索能夠升高AE-IPF大鼠ZO-1、MRP1蛋白水平，表明鹽酸氨溴索通過調節ZO-1和MRP1表達能夠對AE-IPF大鼠的發生發展過程起到保護作用，其中高濃度保護作用最為明顯。

TGF-β1是導致機體纖維化關鍵細胞因子，細胞膜表面受體與TGF-β1進行結合，將其信號轉導到細胞內，TGF-β1能夠誘導Smad相關蛋白的磷酸化，Smads家族蛋白主要是從細胞膜中將信號轉至細胞核中，而相關靶基因與進入細胞核內的信號進行轉錄調節，促進細胞的增殖與分化[18,19]。正常情況下，TGF-β1在細胞內主要以無活性存在，TGF-β1型信號傳遞或者表達需要對應信號轉導路徑實現，其中Smads路徑具有重要的影響，Smads3、Smads4及Smads7是TGF-β1/smads信號轉導路徑內主要信號蛋白，共同調控肺纖維化[20]。本文研究結果顯示，鹽酸氨溴索能夠降低AE-IPF大鼠TGF-β1、smads蛋白水平，從而抑制肺纖維化的發生，其中高濃度抑制效果最為顯著。

綜上所述，鹽酸氨溴索能夠減少AE-IPF大鼠支氣管平滑肌厚度及支氣管黏膜受損面積，通過降低MMP-2、TIMP-1水平，從而改善大鼠氣管損傷，通過調控TGF-β1、smads信號通路蛋白水平，從而抑制模型大鼠肺纖維化的發生，進而對氣管黏膜起到保護作用，呈現濃度依賴。