IL-1β誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞UGRP1表達(dá)及其與Fas/FasL介導(dǎo)凋亡的相關(guān)性

陳翠萍，李阿楠，任翠平，沈際佳，左春林

自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid diseases, AITD)是一種器官特異性自身免疫性疾病，主要包括Graves病(Graves’ disease, GD)和橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)兩種臨床類型[1]。子宮球蛋白相關(guān)蛋白1(uteroglobin-related protein 1, UGRP1)由SCGB3A2基因編碼，主要在氣管、支氣管的上皮細(xì)胞中表達(dá)，在甲狀腺組織中也有少量表達(dá)[2]。人類UGRP1基因定位在染色體5q31-33，這是一個包含一組編碼大量Th2細(xì)胞因子且具有GD易感位點(diǎn)的基因區(qū)域[3-4]。前期研究[5-6]顯示88.4% HT及24.7% GD患者甲狀腺細(xì)胞中表達(dá)UGRP1，而正常甲狀腺細(xì)胞及甲狀腺腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)UGRP1。GD和HT患者甲狀腺組織UGRP1與自殺相關(guān)因子(factor associated suicide, Fas)共表達(dá)，并且UGRP1陽性甲狀腺組織中IL-1β的表達(dá)量高于UGRP1陰性者。IL-1β主要是一種促炎細(xì)胞因子[7]，它在HT患者甲狀腺組織中大量表達(dá)，是唯一誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞Fas表達(dá)的細(xì)胞因子，通過與廣泛存在的FasL結(jié)合誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡[8-9]。在AITD患者尤其是HT患者的甲狀腺組織中UGRP1高表達(dá)，且UGRP1高表達(dá)的甲狀腺細(xì)胞中Fas表達(dá)也增高，但UGRP1高表達(dá)的具體機(jī)制、UGRP1高表達(dá)與Fas共表達(dá)之間是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚。Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡是經(jīng)典的AITD致病機(jī)制，本研究通過應(yīng)用IL-1β誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞，探討甲狀腺細(xì)胞UGRP1表達(dá)及其與Fas/FasL介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑大鼠甲狀腺細(xì)胞FRTL-5(美國ATCC公司)；重組人IL-1β(吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)；抗FasL抗體(美國R&D公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；0.25 %胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；SYBR Premix ExTaq Ⅱ定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Annenxin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 將FRTL-5細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)70%左右時，用胰酶細(xì)胞消化液消化，按1/2或1/3進(jìn)行傳代培養(yǎng)，或者按照合適濃度接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中。用不同濃度(10、20、40 ng/ml)IL-1β刺激細(xì)胞，同時設(shè)置對照組(未加IL-1β)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后期檢測。用IL-1β(40 ng/ml)刺激細(xì)胞，分別培養(yǎng)12、24、48 h，并設(shè)置對照組(0 h)，收集細(xì)胞用于后期檢測。用抗FasL抗體(5 μg/ml)預(yù)處理細(xì)胞45 min后，再加入IL-1β(40 ng/ml)刺激細(xì)胞，同時設(shè)立對照組(未加IL-1β及抗FasL 抗體)、IL-1β(40 ng/ml)組繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后期檢測。

1.2.2Real-time PCR法檢測mRNA 采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考熒光定量PCR檢測試劑盒說明書使用Real-time PCR儀(Bio-Rad CFX96)檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法比較分析目的基因mRNA表達(dá)水平。引物見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置對照組、IL-1β組和IL-1β+抗FasL抗體組。對照組(未加IL-1β及抗FasL抗體)和 IL-1β組(40 ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，IL-1β+抗FasL抗體組先予以抗FasL抗體(5 μg/ml)預(yù)孵45 min，再添加終濃度為40 ng/ml的IL-1β繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化收集細(xì)胞。按照Annenxin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER)檢測。記錄各組的細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β對FRTL-5細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)水平的影響與對照組相比，IL-1β組FRTL-5細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)水平呈劑量-時間依賴性增加。在不同濃度刺激下，20 ng/ml組(1.88±0.22)和40 ng/ml組(2.86±0.52)高于對照組(1.01±0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.35，P=0.000 5)，如圖1A。在不同時間作用下，12 h組(1.92±0.51)、24 h組(2.38±0.09)和48 h組(3.63±0.28)高于對照組(1.00±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.31，P<0.000 1)，如圖1B。

圖1 IL-1β對FRTL-5細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)水平的影響

2.2 IL-1β對FRTL-5細(xì)胞UGRP1 mRNA表達(dá)水平的影響與對照組相比，IL-1β組FRTL-5細(xì)胞UGRP1 mRNA的表達(dá)水平呈劑量-時間依賴性增加。在不同濃度刺激下，10 ng/ml組(1.74±0.27)、20 ng/ml組(2.34±0.45)和40 ng/ml組(2.94±0.22)高于對照組(1.01±0.18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.11，P=0.000 3)，如圖2A。在不同時間作用下，24 h組(1.85±0.17)和48 h組(2.12±0.12)高于對照組(1.01±0.18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.96，P=0.000 2)，如圖2B。

圖2 IL-1β對FRTL-5細(xì)胞UGRP1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 IL-1β及抗FasL抗體對FRTL-5細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示IL-1β(40 ng/ml)組細(xì)胞的早期凋亡率較對照組升高(7.49±1.91%vs28.46±3.17%；t=9.814，P=0.000 6)，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組細(xì)胞的早期凋亡率較IL-1β(40 ng/ml)組降低(28.46±3.17%vs19.20±1.75%；t=4.433，P=0.011 4)，如圖3。

圖3 IL-1β及抗FasL抗體對FRTL-5細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 抗FasL抗體對FRTL-5細(xì)胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表達(dá)水平的影響與對照組相比，IL-1β(40 ng/ml)組，F(xiàn)RTL-5細(xì)胞Fas mRNA(1.01±0.09vs2.75±0.18；t=15.09，P=0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.22±0.31；t=6.687，P=0.002 6)表達(dá)水平增加；與對照組相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組Fas mRNA(1.01±0.09vs3.03±0.16；t=19.38，P<0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.66±0.28；t=9.856，P=0.000 6)表達(dá)水平增加；與IL-1β(40 ng/ml)組相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組Fas mRNA(2.75±0.18vs3.03±0.16；t=2.072，P=0.107)和UGRP1 mRNA(2.22±0.31vs2.66±0.28；t=1.811，P=0.144 4)的表達(dá)水平變化均無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖4A、B。

圖4 抗FasL抗體對FRTL-5細(xì)胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

AITD是由遺傳因素、環(huán)境因素等相互作用而發(fā)生發(fā)展的一種自身免疫性疾病，輔助性T細(xì)胞在調(diào)節(jié)AITD患者甲狀腺免疫反應(yīng)中的重要性已得到充分證實(shí)，GD主要以Th2細(xì)胞引起的體液免疫為主，HT主要以Th1細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫為主[10]。UGRP1作為一種功能機(jī)制尚未明確的蛋白，已被證實(shí)是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1的下游靶基因，該基因在AITD患者的甲狀腺中表達(dá)升高[11]。

AITD患者，尤其HT患者甲狀腺組織高表達(dá)UGRP1[5]，甲狀腺細(xì)胞UGRP1陽性HT患者血清TPOAb及TgAb陽性滴度高于UGRP1陰性患者[6]，而甲狀腺細(xì)胞UGRP1陽性的GD患者經(jīng)過131I治療后更容易發(fā)生甲狀腺功能減退[12]，提示甲狀腺細(xì)胞UGRP1陽性GD患者傾向于HT的自然轉(zhuǎn)歸，推測UGRP1可能作為AITD特別是HT的一種新型生物學(xué)標(biāo)志物，而且對于GD患者的甲減風(fēng)險有一定預(yù)警意義。UGRP1與Fas在AITD患者的甲狀腺細(xì)胞中共表達(dá)，在UGRP1陽性的GD患者中，其甲狀腺組織中浸潤的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)量亦高于UGRP1陰性的患者[5]。本研究應(yīng)用IL-1β刺激大鼠甲狀腺細(xì)胞，結(jié)果顯示在mRNA水平UGRP1和Fas表達(dá)呈升高趨勢，與AITD患者甲狀腺細(xì)胞UGRP1與Fas共表達(dá)且周圍浸潤的IL-1β高表達(dá)相吻合。長期以來Fas/FasL凋亡途徑是AITD尤其是HT的經(jīng)典通路，既往研究[9]表明IL-1β是唯一一種通過Fas/FasL通路誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子，為了探討UGRP1高表達(dá)與Fas/FasL介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，本研究予抗FasL抗體預(yù)孵甲狀腺細(xì)胞，阻斷FasL與Fas相結(jié)合[13]，降低IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示抗FasL抗體預(yù)孵的甲狀腺細(xì)胞早期凋亡率降低，但UGRP1表達(dá)水平并未出現(xiàn)顯著性變化。這一結(jié)果說明IL-1β誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞UGRP1高表達(dá)與Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明IL-1β可以誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞UGRP1與Fas高表達(dá)，并且可以促使甲狀腺細(xì)胞凋亡，但UGRP1高表達(dá)與Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不相關(guān)。UGRP1與Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步深入研究。