HB-EGF和uPAR在子癇前期中發(fā)病的聯系

陳 繁，張 英，謝絲雨

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠所特有的疾病，若進一步發(fā)展為子癇，可引起孕產婦抽搐，對心臟、肝臟、腎臟等各重要器官造成不可逆的功能損害。同時子癇前期孕婦宮內環(huán)境較差，引起胎兒慢性缺氧，導致胎盤早剝，造成胎死宮內等不良妊娠結局[1]。一項薈萃實驗表明，患有子癇前期的孕婦，以后患高血壓的概率是正常人4倍，患心臟病的概率比正常人高兩倍[2]。目前有證據支持胎盤在疾病的發(fā)生中起著重要的作用，終止妊娠娩出胎盤才能阻止疾病的發(fā)展。滋養(yǎng)細胞異常浸潤導致螺旋動脈的重鑄缺陷、內皮細胞功能障礙是目前的共識[3]。本研究主要探究肝素結合型表皮生長因子(hepafin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF)和尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)是否與子癇前期的發(fā)病相關。

1 材料與方法

1.1 病例資料首先選擇2018—2020年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院產科住院分娩孕婦80例，其中30例正常足月妊娠，50例子癇前期病例，隨機選取其中4例子癇前期患者以及3例正常足月妊娠患者的血清進行蛋白芯片技術篩選差異性蛋白。其子癇前期組納入標準參照美國婦產科醫(yī)師協會(ASOG)于2020年發(fā)布的對于子癇前期的診斷[4]，納入標準：① 妊娠20 周后出現收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，伴尿蛋白陽性；② 無蛋白尿但合并以下任何一項者：血小板減少；肝功能異常；腎功能損害；肺水腫；新發(fā)的中樞神經系統異常或視覺障礙。排除標準：① 既往患高血壓；② 糖尿病；③ 甲狀腺功能異常；④ 妊娠期肝內膽汁瘀積癥；⑤ 肝臟以及腎臟疾病等合并癥的孕婦。研究對象均無吸煙史以及長期服藥史。所有參與患者均為剖宮產方式終止妊娠并均簽署知情同意書，本研究獲得安徽醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(批號：P2020-12-22)。

1.2 標本保存和試劑于孕婦手術當天空腹采取靜脈血2～3 ml，室溫25 ℃靜置30 min，2 h后離心(3 000 r/min，10 min)，收取上清液，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。術中收集胎盤組織浸泡于5倍體積的RNAlater液中，4 ℃過夜，轉移至-80 ℃冰箱保存。樣本使用時在常溫融化后研磨提取RNA。酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自美國R&D system公司；抗體購自美國GeneTex公司；GSH-CAA-400試劑盒購自美國RayBiotech公司；組織RNAFixer儲存液購自北京普魯頓生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen生物有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司設計，并購自該公司。

1.3 抗體芯片技術從患者獲得的血清用于鑒定基因通過人類細胞因子抗體陣列顯示子癇前期患者中的差異表達。實驗步驟按照GSH-CAA-400試劑盒說明書嚴格進行。具體步驟如下：將樣品稀釋液與玻片芯片室溫反應1 h后，抽去稀釋液后，加入樣品4 ℃孵育過夜，在用專用洗滌液充分洗滌，洗去非特異性結合物，加入檢測抗體，室溫搖床孵育2 h，再次充分洗滌后，加入Cy3-鏈霉親和素后，室溫避光搖床孵育1 h后，運用InnoScan 300微陣列掃描儀，使用RayBiotech分析工具對數據進行標準化。再將原始數據進行歸一化處理，運用Normalization 數據來做分析并進行組間比較。

1.4 ELISA采用ELISA試劑盒檢測血清中HB-EGF、uPAR中的濃度。ELISA實驗前，將所收集的樣本置入冰上解凍，渦旋混勻。HB-EGF血清樣本未進行稀釋，uPAR血清樣品運用樣品稀釋液稀釋5倍，渦旋進行混勻。每個孔加入100 μl的RD1W分析稀釋液后，標準孔加入50 μl標準品，實驗孔加入50 μl的稀釋后的血清樣本，室溫孵育2 h，充分洗滌，向每孔加入200 μl的uPAR結合物或者HB-EGF結合物，室溫孵育2 h，再次進行充分洗滌，向每孔加入200 μl提前配好顯色劑避光孵育30 min，每孔加入50 μl終止液，在30 min內放上酶標儀上測定450 nm處的吸光度值。根據標準孔計算標準曲線，根據標準曲線計算每個孔對應的濃度值。

1.5 實時熒光定量PCR將胎盤組織進行剪碎，加入1 ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理，室溫靜置30 min，取澄清的勻漿液，加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩后室溫放置30 min，4 ℃ 、10 000 r/min離心15 min,把水相轉移到新EP管中，加入異丙醇500 μl沉淀水相中的RNA，室溫放置60 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去上清，用含DEPC的70%乙醇洗滌，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄上清，用DEPC水溶解RNA沉淀，測定RNA濃度和純度。按照試劑盒說明書嚴格操作將RNA逆轉錄合成cDNA。引物序列(5′-3′)分別為uPAR 上游：5′-GGTGAAGAAGGGCGAAAGG-3′，下游：5′-CCAGAGTAGCGTTCGAGTG-3′； HB-EGF上游：5′-TTATCCTCCAAGCCACAAGCACTG-3′,下游：5′-GATGACCAGCAGACAGACAGATGAC-3′；內參β-actin 上游：5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′,下游：5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。PCR反應體系為20 μl，反應條件95 ℃、30 s，95℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環(huán)。同時每個樣本設置復孔，采用2-△△ct計算uPAR和HB-EGF的表達水平，其中ct值為循環(huán)閾值。

1.6 免疫組化采用免疫組化SP法檢測蛋白表達水平。組織標本切片置于65 ℃烤箱中烘烤60 min后，立即置于二甲苯中15 min，梯度乙醇脫水，水平搖床上用PBS液浸洗3遍，室溫下將切片置于0.3% Triton X-100中30 min，枸櫞酸鹽緩沖液中高壓修復，自然冷卻，切片浸于PBS液浸洗3遍；山羊血清37 ℃封閉1 h，輕輕甩去血清，一抗HB-EGF按1 ∶50稀釋，uPAR按1：700稀釋，陰性對照采用PBS代替一抗，4 ℃過夜，PBS浸洗3次，二抗37 ℃孵育30 min后DBA顯色，將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。將顯色后的片子用清水沖洗復染。結果判定由本院病理科醫(yī)生閱片后判定。以細胞膜出現黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞，根據每份標本中的陽性細胞染色強度所占百分比進行評定，采用Image J進行平均吸光密度值分析。

1.7 統計方法應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。先判斷計量資料是否符合正態(tài)分布，若計量資料符合正態(tài)分布，則以進行描述，并且兩組數據運用t檢驗的方式，若計量資料不符合正態(tài)分布，數據運用中位(四分位間距)進行描述，運用非參數檢驗等統計學方法進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本臨床數據對納入研究的孕婦年齡、體質指數(body mass index,BMI)、孕周、收縮壓、舒張壓、新生兒出生體質量、Aparg評分、NICU住院時間等臨床信息進行統計，見表1。子癇前期組與正常孕婦相比，年齡和BMI (P>0.05)，終止妊娠孕周(P<0.05)，收縮壓、舒張壓、新生兒出生體質量、1和5 minApgar評分比較(P<0.01)。

表1 樣本臨床信息

2.2 差異表達蛋白篩選使用RayBiotech分析工具對抗體芯片篩查原始數據用軟件歸一化后，選擇Normalization數據來做分析。采用P值和Foldchange對差異蛋白進行篩選，P<0.05且Foldchange < 0.83 或者>1.2，在篩選出的12個差異蛋白中有10個蛋白在子癇前期中上調，IL-2Ra、IL-23、VEGFR1、Nidogen-1、Thrombomodulin、Transferrin、IP-10、Insulin、IL-10、uPAR；2個蛋白在子癇前期中下調，CEACAM-1及HB-EGF。見表2。

表2 抗體芯片技術篩選子癇前期與正常孕婦的差異蛋白

2.3 子癇前期組和對照組血清中HB-EGF與uPAR的濃度本次研究共篩選了12個蛋白指標，通過大量閱讀文獻，選取其中2個差異蛋白，即 HB-EGF和uPAR。HB-EGF的ELISA結果的數據資料顯示其為偏態(tài)分布，子癇前期組為43.19(61.18) ng/L，對照組65.82(21.85) ng/L，子癇前期患者血清中的HB-EGF的濃度是低于正常孕婦組，P=0.043，兩組差異有統計學意義。見圖1A。uPAR的ELISA實驗結果的數據資料顯示其呈現正態(tài)分布，子癇前期組為(2 143.65±810.97) ng/L，對照組為(1315.11±191.35)ng/L，子癇前期患者血清中uPAR的濃度是高于正常孕婦組，差異具有統計學意義(t=2.907，P=0.006)。見圖1 B。見圖1B。

圖1 HBF、uPAR在各組血清中的濃度分布

2.4 子癇前期組和對照組胎盤uPAR及HB-EGF的表達應用 qRT-PCR技術測定胎盤中uPAR mRNA及HB-EGF mRNA的表達，其結果顯示，不論是正常胎盤還是子癇前期胎盤中uPAR的表達量極低，甚至不表達(結果未顯示)，子癇前期組胎盤中HB-EGF mRNA表達量(0.74±0.17)，正常對照組(0.29±0.19)，差異有統計學意義(t=3.764，P=0.006)。進一步采用免疫組織化學的方法比較子癇前期患者和正常妊娠對照組胎盤中uPAR及HB-EGF的蛋白表達。uPAR在正常孕婦及子癇前期患者胎盤呈陽性表達(圖2A、B)，在子癇前期患者胎盤中的表達低于正常孕婦，正常孕婦吸光度值中位數10.367(5.61)，子癇前期孕婦組平均吸光度值中位數6.01(7.61)，運用非參數檢驗，P=0.037，差異有統計學意義。HB-EGF在正常妊娠中呈陽性表達，在子癇前期組表達量極低，甚至不表達(圖2C、D)，通過測量平均光密度，數據資料呈正態(tài)分布，在正常孕婦組平均光密度值(7.91±1.66)，子癇前期組平均光密度值(3.91±2.67)，差異有統計學意義(t=3.004，P=0.009)。

圖2 胎盤HB-EGF及uPAR在子癇前期及對照組中的免疫組化 ×400

3 討論

本研究通過蛋白質芯片技術對子癇前期孕婦和正常孕婦血清中440種細胞因子進行分析，篩選出了12個差異蛋白。這些差異蛋白在炎癥反應、細胞分化及遷移、凝血酶異常等方面具有關鍵作用，為子癇前期發(fā)病機制的深入研究提供了方向及依據。HB-EGF和uPAR與滋養(yǎng)細胞的侵襲能力有關，在胚胎著床中起著關鍵作用，并且目前對于這兩種蛋白的研究較少。

HB-EGF可激活表皮生長因子家族中ERBB/HER酪氨酸激酶受體，將生長因子的信號傳導到細胞內，調節(jié)細胞對外界的刺激反應、細胞增殖、存活、黏附、遷移和分化等，對于胚胎發(fā)育是必需的[5]。它處于與子癇前期相關的病理生理異常的交匯點，即它的活性調節(jié)著滋養(yǎng)細胞浸潤或滋養(yǎng)細胞細胞凋亡[6]。子癇前期患者的胎盤顯示滋養(yǎng)細胞凋亡增加,而HB-EGF的外源性應用可防止細胞凋亡及缺血再灌注損傷,HB-EGF的下降可以導致保護細胞免受氧化應激和內皮功能障礙的細胞系統失衡，尤其在妊娠早期，HB-EGF的缺乏可以阻礙細胞滋養(yǎng)層干細胞向絨毛外表型轉化構成了先兆子癇的關鍵因素[7]。uPA系統在細胞侵襲、黏附和遷移中起著關鍵作用[8]。uPA可與uPAR結合，促進基質金屬蛋白酶(MMPs)的分泌。MMPs能夠降解細胞外基質中的成分，從而促進細胞入侵，MMPs的降低已證明與子癇前期有關[9]。

該研究通過比較子癇前期患者和正常妊娠對照組血清及胎盤中uPAR和HB-EGF的表達量,結果表明uPAR在子癇前期患者血清中表達升高，胎盤中表達失衡，mRNA表達水平極低甚至無表達，蛋白表達水平低于正常孕婦組。HB-EGF在子癇前期組血清中表達降低，胎盤中mRNA水平表達量降低，蛋白水平表達量降低，甚至無表達，由此推測它們在子癇前期的發(fā)病中起保護性作用，相關的發(fā)病機制涉及滋養(yǎng)細胞的遷移侵襲以及血管內皮功能失調。

目前的實驗設計在選擇臨床樣本時只考慮了子癇前期這一影響因素，忽略了孕周對于胎盤蛋白的表達可能存在的潛在影響，所以標本的收集存在對照組及子癇前期組孕周不匹配的情況，接下來會進一步選取孕周匹配的對照組進行研究，同時也會將分組細化到孕周，了解不同孕周uPAR及HB-EGF的表達是否有差異，從而為子癇前期發(fā)病機制的研究以及臨床預測治療提供更多有效的線索。