慢性肝病患者中小腸細菌過度生長的研究

黃夢雪，陳 剛，王 鵬，曹世國，許建明，梅 俏，洪汝濤，張衛平

肝硬化是一種常見的消化系統疾病，它是各種慢性肝病發展的終末階段，以肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成為特征[1]。近年來研究[2-3]表明肝纖維化的發生以及肝硬化發病與腸道菌群失調有著密切關系。腸道菌群是指在小腸內各種細菌的統稱，它在宿主的消化、代謝、免疫等功能中發揮重要作用。小腸細菌過度生長(small intestinal bacterial overgrowth，SIBO)是指小腸菌群的密度增加和組成類型的改變[4]。該研究旨在通過乳果糖氫呼氣試驗(lactulose hydrogen breath test，LHBT)的方法初步檢測SIBO在慢性肝炎肝硬化(chronic hepatitis fibrosis，CHF)以及肝硬化患者中的發生率，并通過檢測炎癥因子及氧化應激相關指標水平及其與LHBT集值的相關分析來揭示可能參與的SIBO發生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年9月—2019年9月在安徽醫科大學第一附屬醫院就診的CHF患者和肝硬化患者，其診斷基于病史、臨床癥狀和體征、生化病理學檢查和影像學檢查。

排除標準包括：① 入院前4周內使用抗生素或益生菌； ② 入院前2周內服用促動力藥； ③ 2周內急性上消化道出血； ④ 4周內結腸鏡檢查和灌腸；⑤ 患有嚴重的呼吸系統疾病或其他可能影響胃腸動力疾病； ⑥ 胃腸切除術既往史(不包括闌尾切除術)。經過篩查，共有38例CHF患者和60例肝硬化患者符合入組標準。另選擇31例健康對照組：年齡與以上兩組相近；無明確的消化道疾病既往史；無呼吸系統疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等；無長期服用藥物史；近1年內無大量吸煙史、飲酒史。

1.2 主要試劑與儀器乳果糖口服溶液(商品名杜密克)購自美國雅培制藥有限公司，LPS檢測試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司，IL-6、TNF-α、IL-10、DAO、CAT、SOD、GSH檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，Sunvou-P200型納庫侖呼氣分析儀購自無錫尚沃醫療公司。

1.3 LHBT實驗LHBT按照羅馬會議共識建議的標準[5]進行。要求受試者實驗前24 h內避免食用高產氫的食物，并注意避免過飽；空腹至少12 h；測試開始前避免劇烈運動，以減少對腸蠕動和肺通氣的影響。研究選用無錫尚沃醫療公司研發的Sunvou-P200型納庫侖呼氣分析儀，該儀器可同時檢測呼氣中的氫氣和甲烷的濃度。呼氣樣本中的氫氣、甲烷濃度以 ppm(百萬分之一)表示。首先使用標準氣體進行校準，測試基礎呼氣中氫氣、甲烷濃度后囑患者快速服下乳果糖溶液10 g，30 min后測量1次,持續3 h，記錄各時間點氫氣和甲烷的濃度數值，并將測得的氫氣濃度相加計作LHBT集值[6]。

1.4 診斷標準參考北美共識會議[7]結論現擬定以下診斷標準： ① 基礎呼氣中氫氣濃度≥20 ppm或甲烷≥10 ppm，且每隔 30 min復測，氫氣濃度均≥20 ppm或甲烷濃度≥10 ppm; ② 服用乳果糖后，出現典型的氫氣雙峰圖形(小腸峰和結腸峰)，第1個峰起始點在 90 min 之前出現，較空腹值至少升高12 ppm。符合上述二者之一的即為SIBO陽性，反之則為SIBO陰性。

1. 5 血清學指標檢測采集受試者空腹靜脈血2 ml，靜置 30 min 后分離出血清(4 ℃、1 200 r/min，5 min)，置于-80 ℃冰箱保存。血清學指標檢測嚴格根據試劑盒說明書執行。

2 結果

2.1 一般資料共納入對照組共31例，CHF組38例，肝硬化患者60例。3組受試者性別、年齡以及BMI間分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、CHF組和肝硬化組資料的比較

2.2 對照組、CHF組和肝硬化組SIBO發病率的比較肝硬化組SIBO率高于CHF組，兩組均高于對照組的SIBO陽性率，差異有統計學意義(χ2=21.785，P<0.01)。受試者SIBO陽性者和陰性者在性別、年齡、BMI、門靜脈血栓、白蛋白上的差異無統計學意義(P>0.05)，而SIBO陽性組的腹水發生率高于SIBO陰性組，CTP分級中B/C級SIBO的發生率高于A級中SIBO的發生率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 對照組、CHF組和肝硬化組SIBO陽性率

表3 SIBO陽性組和陰性組各項指標的比較

2.3 血清炎癥因子和氧化應激指標的比較對肝硬化SIBO陽性組和陰性組受試者血清中內毒素(LPS)和IL-6、IL-10、TNF-α進行比較，結果顯示SIBO陽性組血清中TNF-α和IL-10的水平與陰性組差異無統計學意義(P>0.05)，LPS和IL-6水平前者高于后者，差異有統計學意義(P<0.05)。

在所檢測的氧化應激指標方面，SIBO陽性組血清中的GSH濃度與陰性組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而血清中DAO、SOD、CAT濃度則高于陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 血清炎癥因子和氧化應激指標的比較

2.4 LHBT集值與炎癥因子和氧化應激指標的相關性分析將患者的LHBT集值與LPS、TNF-α、IL-6及IL-10作相關分析，結果表明患者LHBT集值與LPS和IL-6呈正相關(P<0.05)，與TNF-α及IL-10無明顯相關(P>0.05)。將患者的LHBT集值與氧化應激指標DAO、SOD、GSH及CAT作相關性分析，結果顯示LHBT集值與DAO、SOD、CAT呈正相關(P<0.05)，與GSH無明顯相關(P>0.05)。見表5。

表5 LHBT集值與炎癥因子和氧化應激指標的相關性分析

3 討論

目前全球約有20億人感染HBV，預計其中10%～20%終將轉化為肝硬化甚至肝癌，嚴重威脅人類健康[8]。當肝臟病變乃至肝硬化時，患者腸道蠕動減慢、胃內pH升高、膽汁酸分泌減少等會導致SIBO及菌群易位。LHBT是一種無創的診斷 SIBO 的方法，通過檢測結腸內菌群對碳水化合物酵解產生并隨呼吸排出(腸道內產生的氫氣約14%～20%由肺排出)的氫氣濃度初步判斷腸道內菌群的狀態(此外約有30%成人腸道內含有產甲烷菌，可消耗氫氣生成甲烷，因此同時檢測呼氣中的氫氣和甲烷能提高SIBO的檢出率[9])。國外文獻[10]報道基于以小腸抽吸液菌落計數的結果為參照，LHBT的敏感性可達86%，特異性可達78%～100%，說明其檢測結果與既往的“金標準”檢測結果基本一致。正常情況下，乳果糖后被結腸內細菌分解產生氫氣，若此時進行LHBT會出現氫呼氣單峰；而存在SIBO時呼氣中氫濃度提前升高或出現雙峰圖形(表明底物在小腸內被提前酵解)。

該研究結果顯示肝硬化組SIBO的發生率高于CHF組，均高于對照組。另外肝硬化SIBO陽性組肝硬化病變嚴重程度及腹水的發生率高于陰性組(P<0.05)，這與Pande et al[11]的研究結果相似。此外，Pande et al[11]的研究表明血清膽紅素水平≥2 mg/dl且合并腹水的肝硬化患者患SIBO的概率達82%，而此兩者均不存在的肝硬化患者發生SIBO的概率僅為10%。這表明此兩項指標在氫呼氣試驗以及不能進行空腸抽吸的情況下對于預測SIBO的存在有一定的幫助。

該研究結果顯示SIBO陽性組患者血漿中的內毒素、IL-6水平高于SIBO陰性組，而IL-10、TNF-α在兩組間差異無統計學意義。血清中內毒素升高可導致肝細胞對K+的通透性增高 , 使線粒體腫脹進而導致ATP生成受阻，引起肝細胞腫脹壞死。Toll 樣受體(TLR)是一種重要的模式識別受體，通過識別多種細菌、病毒等的相關結構成分來激活免疫反應。其中TLR4作為LPS的天然配體，當血清中LPS升高時結合CD14作用于固有免疫細胞表面的TLR4，經 MyD88依賴性信號途徑和 MyD88非依賴性信號途徑，刺激引發炎癥級聯反應，造成各種促炎癥介質如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等增多[12]，對肝臟造成進一步的損害。此外細菌DNA介導的巨噬細胞活化會導致TNF-α、IL-6和IL-12的合成，后兩種細胞因子能激活B細胞以及T細胞并通過自然殺傷細胞的激活來調節IFN-γ的產生。由于IFN-γ受體也在巨噬細胞表面表達，IFN-γ水平的增加進一步促進了TNF-α的產生，并上調了誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因的轉錄，導致巨噬細胞一氧化氮(NO)合成能力的增加[13]。NO的增高使胃腸道及血管平滑肌膜電位超極化，致使胃腸平滑肌的松弛及局部淤血的發生，從而導致腸蠕動的減慢，增加腸道細菌及毒素的吸收，進一步加重肝硬化患者肝功能的損害從而形成惡性循環[14]。

DAO是廣泛存在于小腸黏膜上層絨毛細胞中高度活性的細胞內酶。生理條件下,血液中 DAO含量很低，腸道被損傷后腸道絨毛上皮細胞將其釋放并進入血液循環,血液中DAO含量與腸黏膜損傷程度呈正相關[15]。因此，SIBO陽性患者體內DAO濃度升高佐證了腸道菌群的增加損傷腸黏膜使其通透性增加。CAT、SOD等是體內主要的抗氧化酶，在消除ROS的過程中起重要作用。CAT活性的增加可以抵御氧化應激對紅細胞膜的有害影響，而SOD和CAT活性的增高可能是抑制脂質過氧化導致自由基擴增的一種保護機制。