獼猴下丘腦-垂體-腎上腺軸組織結構學特征觀察

董婷玉，郭夢慧，許昌勇，蔣海峰，張 磊，許 振，劉瀟一，嚴尚學，常 艷，魏 偉

下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPAA)由下丘腦、垂體、腎上腺組成，調節機體能量代謝，維護內環境[1]。生理應激時，下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin releasing hormone，CRH)，促進垂體釋放促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，使腎上腺分泌糖皮質激素(glucocorticoid，GC)，GC又負反饋作用于下丘腦和垂體[2]。HPAA異常時，體內穩態失衡，如自身免疫病患者長期使用GC，腎上腺皮質功能不全，皮質醇缺乏，炎癥加重[3]。庫欣綜合征表現為HPAA亢進，皮質醇分泌過多，誘發骨質疏松和感染[4]。治療此類疾病多為恢復HPAA功能，因此對HPAA生理及病理反應研究尤為重要。目前對HPAA的研究集中于嚙齒動物[5]或臨床病例分析[6]，也有對麋鹿[7]、水牛[8]、樹齁[9]等動物HPAA部分組織病理的特征觀察，對非人靈長類HPAA全面系統性的組織結構特點卻鮮有報道。與其他動物相比，非人靈長類具有與人類相近的基因序列和神經解剖結構，是進行腦部研究最理想的實驗動物[10]。本研究探討了獼猴HPAA幾種病理切片的制作方法，對組織結構做了詳細描述，為更好的模擬人類HPAA生理和病理特征提供了技術方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級實驗獼猴(雄性，年齡3～5歲)，由旌德縣皖南獼猴馴養繁殖基地提供[SCXK(皖)2020-001]，飼養于安徽醫科大學臨床藥理研究所普通級猴飼養中心，濕度：(40～70)%；溫度：(21～26)℃；7:00 am～7:00 pm光照，自由攝取維持飼料和水，額外補充瓜、果、蔬、蛋、奶等食物來滿足獼猴的營養需要，嚴格按照動物倫理福利規定的標準開展實驗。所有實驗方案均經安徽醫科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會審查批準同意(批號：PT-2020-001)。

1.2 實驗試劑注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(舒泰50)購自上海維克有限公司(批號：200826 12C BN 82T7A)安徽公司；DAPI染色液、Triton-X、EDTA抗原修復液購自北京Solarbio公司；DAB顯色試劑盒、通用型試劑盒(小鼠/兔聚合物法檢測系統)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木精染液、HE染液套裝、抗熒光淬滅劑購自武漢Servicebio公司；兔抗CRH抗體、小鼠抗ACTH抗體、兔抗MAP2抗體購自美國Proteintech公司；兔抗GR抗體、兔抗ACTH-R抗體、兔抗CRFR1抗體購自美國Immunoway公司；兔抗iba-1抗體購自日本Wako公司；熒光標記山羊抗小鼠IgG AF 488購自武漢Elabscience Biotechnology公司；熒光標記山羊抗兔IgG AF 594購自美國Jackson公司。

1.3 實驗儀器組織脫水機購于湖北康龍電子科技有限責任公司；組織攤烤片機、包埋機購于湖北亞光醫用電子技術有限公司；石蠟切片機、冰凍切片機購于Thermo Scientific公司；脫色搖床購于武漢Servicebio公司；恒溫烘箱購于上海福瑪實驗設備有限公司；微波爐購于廣東Galanz公司；正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、全自動免疫組化染色儀購于德國Leica公司。

1.4 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織取材與保存在獼猴情緒平穩的狀態下，按6 mg/kg肌肉注射鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮至深度麻醉，采用股動脈放血進行安樂死。在解剖臺上分離軀干和頭顱，去除頭部皮膚和附著肌肉，用電鋸從眉骨、顳骨、枕骨上方環狀鋸開，揭開顱頂骨和軟腦膜，暴露并剝離出大腦，冰上迅速取出下丘腦(圖1A)，從垂體窩中挑出垂體(圖1B)，同時打開腹部，于肝腎之間取出左、右腎上腺(圖1C)，固定于預冷4%多聚甲醛溶液(PFA)中。

1.5 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織石蠟切片制作新鮮組織用4% PFA固定24 h以上，修剪目標組織，放入自動脫水機：70%、80%、90%、95%、100% Ⅰ、100%Ⅱ 乙醇各1 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 各30 min，55 ℃融化石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1 h。從脫水盒內取出組織放入包埋框內，-20 ℃冷卻凝固，修齊表面后用切片機切片，厚4 μm，于攤片機40 ℃溫水上攤平，載玻片撈片，烘箱60 ℃烤干取出，室溫保存。

1.6 獼猴下丘腦組織冰凍切片制作4 ℃冰箱內，新鮮組織用4% PFA固定24 h以上，轉入20%蔗糖溶液，沉底后換30%蔗糖溶液，再次沉底即可。脫水完成后取出，修齊組織，用OCT包埋劑將組織固定在樣本托上速凍，待OCT變白變硬即可進行切片。先粗切修齊組織面，再細切，厚度8～10 μm，粘附載玻片貼切片，-20 ℃保存。

1.7 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色石蠟切片首先經60 ℃烘至蠟融化，而后二甲苯I、II各20 min，100%I、100%II、95%、85%、75%乙醇各5 min，流水沖洗進行脫蠟；蘇木精染色5～10 min，分化液分化20 s，返藍5 min，流水沖洗后85%、95%酒精各5 min，行伊紅染色3 min；最后經75%、85%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min脫水，中性樹膠封片。

1.8 獼猴下丘腦-垂體-腎上腺免疫組織化學染色石蠟切片脫蠟后，經0.5% Triton-X室溫30 min通透；用沸騰的EDTA抗原修復液余溫修復切片10 min；內源性過氧化物酶阻斷劑室溫避光10 min；5% BSA室溫封閉1 h；滴加稀釋后的一抗：CRH、ACTH、CRFR1(1 ∶100)；ACTH-R(1 ∶200)；GR(1 ∶50)，濕盒內4 ℃過夜；次日拿出切片復溫，洗去一抗，滴加與一抗相應種屬的二抗，室溫20 min；滴加新配制的DAB顯色液，鏡下控制顯色時間，流水沖洗終止顯色；蘇木素染色20 s，分化，返藍，流水沖洗后脫水封片。

1.9 獼猴下丘腦組織石蠟切片免疫熒光染色切片同上述方法脫蠟、通透、抗原修復、封閉后，滴加稀釋的一抗：iba-1(1 ∶500)、MAP2(1 ∶100)，濕盒4 ℃過夜；第二日拿出切片復溫，洗去一抗，滴加與一抗相應種屬的熒光二抗，室溫避光1 h后DAPI染液室溫避光10 min染細胞核；自發熒光淬滅劑室溫避光5 min；抗熒光淬滅封片劑封片，蓋玻片四角用中性樹膠固定，4 ℃避光保存。切片于激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.10 獼猴下丘腦組織冰凍切片免疫熒光染色冰凍切片于37 ℃ 、(10～20) min，4% PFA固定30 min后，用5% BSA和0.5% Triton-X混合液室溫封閉通透1 h；而后同上述1.9的方法進行一抗、二抗敷育、DAPI染核、淬滅組織熒光、封片、鏡檢。

2 結果

2.1 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織解剖形態學觀察從腦底面觀，下丘腦位于丘腦溝以下，前方是視交叉，呈現中空漏斗狀，重量約為2 g，主要包括乳頭體、結節部和視上部(圖1A、B)。揭開全腦，斷開視交叉，可見垂體陷于顱骨蝶鞍垂體窩內，剝離硬腦膜，挑出垂體，形似直徑5 mm的碗豆狀結構(圖1C、D)。腎上腺左右各一，位于兩側腎臟的上方，被腎筋膜和脂肪組織所包裹，左腎上腺稍大，如半月形，右腎上腺稍短，為錐形(圖1E、F)。

圖1 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織解剖形態學

2.2 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織病理切片HE染色

2.2.1下丘腦組織病理切片HE染色 主要分布著神經元細胞和小膠質細胞(圖2B▲)，正常神經元胞體呈錐形，核大居中，胞質中均勻分布強堿性尼氏體(圖2B黑色箭頭)，深色神經元即壞死神經元，細胞核固縮，胞體縮小變形，尼氏體消失不見，被增生的膠質細胞吞噬(圖2C白色箭頭)。

2.2.2垂體組織病理切片HE染色 由腺垂體(anterior lobe)和神經垂體(posterior lobe，PL)組成，兩部分之間界限清楚，腺垂體又可分為遠側部(pars distalis，PD)和中間部(pars intermedia，PI)(圖2D)；遠側部主要分布著嫌色細胞(圖2E黑色箭頭)、嗜酸性細胞(圖2E白色箭頭)及嗜堿性細胞(圖2E▲)，細胞集合成團索狀；中間部(圖2F*)是位于遠側部與神經垂體之間的狹窄部分，主要分布嗜堿性細胞和嫌色細胞；神經垂體主要由無髓神經纖維和神經膠質細胞組成，也縱橫毛細血管，高倍鏡下神經垂體內的嗜酸性團塊為神經軸突內的分泌物，稱為赫令體(圖2G黑色箭頭)。

2.2.3腎上腺組織病理切片HE染色 由周邊皮質和中央髓質(medulla，M)構成，表面包以結締組織被膜(capsule，C)，皮質由外向內分別為球狀帶(zona glomerulosa，ZG)、束狀帶(zona fasciculata，ZF)和網狀帶(zona reticularis，ZR)(圖2H)；球狀帶較薄，細胞為卵圓形，胞質少，核深染呈球形，細胞排列成球狀，團塊或拱形(圖2I)。束狀帶位于球狀帶深面，是皮質中最厚的部分，細胞大，多邊形，部分有雙核，核圓形，染色淡，胞質有嗜酸性大脂滴，細胞排列成束，呈放射狀伸向髓質(圖2J)；網狀帶細胞相互排列成網，胞漿少，內含脂褐素和脂滴，核深染(圖2K)；髓質由排列成團的髓質細胞、結締組織和大量血竇組成，胞體較大，呈卵圓形(圖2L)。

圖2 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺組織HE染色圖

2.3 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺免疫組織化學染色

2.3.1下丘腦組織病理切片免疫組化染色 圖3A是對下丘腦區域分泌的CRH進行免疫組化染色，可見下丘腦室旁核神經元胞質有棕黃色陽染；對CRH分泌起負反饋調節作用的糖皮質激素受體(GR)多表達在細胞質中，也有部分表達于細胞核，圖3B神經元胞核中GR陽性顆粒明顯。

2.3.2垂體組織病理切片免疫組化染色 腺垂體合成釋放ACTH，圖3C中垂體嗜堿性細胞質中充盈著陽染的ACTH黃色顆粒；接受下丘腦釋放的CRH的CRHR1表達于胞膜(圖3D)；GR主要位于垂體中間部細胞核和細胞質中(圖3E)。

圖3 獼猴下丘腦、垂體、腎上腺免疫組織化學染色圖 ×400A：下丘腦CRH染色；B：下丘腦GR染色；C：垂體ACTH染色；D：垂體CRHR1染色；E：垂體GR染色；F：腎上腺ACTHR染色

2.3.3腎上腺組織病理切片免疫組化染色 腺垂體釋放的ACTH與腎上腺皮質束狀帶細胞上的ACTHR結合，如圖3F所示，ACTHR表達于胞膜上。

2.4 獼猴下丘腦免疫熒光染色圖4、圖5是對獼猴下丘腦區域離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule 1，iba-1)和微管相關蛋白2(microtubule associated protein 2，MAP2)進行免疫熒光染色。從merge圖上可以清楚的觀察到iba-1在小膠質細胞核中表達，MAP2在神經元胞質中表達。通過比較冰凍切片和石蠟切片的熒光染色效果，可以看出，腦組織石蠟切片在經過脫水脫蠟等步驟后，組織中抗原的性質易受到破壞，且操作過程較繁瑣，染片背景較深較雜，出現較多的非特異性染色，反觀冰凍切片染色圖，背景清晰明亮，細胞形態結構易于辨認，效果優于石蠟切片。

圖4 獼猴下丘腦iba-1免疫熒光染色圖 ×1 000

圖5 獼猴下丘腦MAP2免疫熒光染色圖 ×1 000

3 討論

HPAA作為“神經-內分泌-免疫”(neuro-endocrine-immune，NEI)調節網絡的三大軸之一，當受到刺激時，大腦發出信號，以適應環境。下丘腦最先接收到信息，興奮CRH神經元，興奮投射至正中隆起，釋放CRH到垂體門脈系統到達垂體前葉，與CRH受體(CRHR1)結合，CRHR1是一種G蛋白偶聯受體，激活腺垂體ACTH生成細胞釋放ACTH入血到達腎上腺，與腎上腺皮質束狀帶細胞上ACTH受體(ACTHR)結合，刺激其分泌GC(人類合成皮質醇，嚙齒動物合成皮質酮)[11]。皮質醇進入體循環后，與分布于機體各組織器官的核受體GR結合，參與包括壓力反應、糖代謝、炎癥反應及情緒改變等多個調節過程[12]。皮質醇又可與位于下丘腦及腺垂體上的GR結合，負反饋抑制CRH及ACTH的合成，其中任何一個環節發生異常都會影響HPAA的功能，導致NEI網絡失調，對機體造成不可逆轉的損傷[1]。該實驗以獼猴為實驗動物，探討了多種有效病理染色方法，系統性地研究HPAA各級組織器官的組織結構學特征，并做了詳細描述，也檢測了各組織水平上分泌的激素及表達的激素受體，細化到了各蛋白的表達位置。其中iba-1是中樞神經系統中的小膠質細胞特異性標記蛋白，小膠質細胞是腦固有巨噬細胞，在腦損傷時快速感測神經障礙并被活化，遷移到損傷部位，發揮吞噬死細胞、產生促炎因子等功能[13]。MAP2存在于神經元中，構成細胞骨架，塑形神經元，其缺失會導致神經功能障礙[14]。這兩種蛋白的表達情況可以作為下丘腦神經元發生炎癥病理損傷的評價指標。以上研究從組織結構形態學的角度更清晰直觀的表現出HPAA通過各激素和激素受體發揮調節機體內環境的作用，為更好的模擬人類HPAA各環節的生理和病理特征提供了方法參考。

由于實驗時間限制，該研究只觀察了正常獼猴的HPAA組織形態學，接下來將聚焦到某一疾病模型，觀察病理狀態下的HPAA軸功能改變。