miR-203a-3p.1調控VCAN作為胃癌潛在治療靶點的生物信息學研究*

智鵬柯，石 見，周 博，楊言通，陳 曄△

河南科技大學第一附屬醫院:1.胃腸腫瘤外科;2.神經內科，河南洛陽 471003

胃癌發病率位居我國惡性腫瘤第3位，其病死率位居惡性腫瘤第2位[1]。我國胃癌患者被發現時70%已為進展期，5年生存率僅30%[2]。目前，胃癌的靶向治療只有抗Her-2治療，其在晚期胃癌中可延長中位生存時間2.7個月，但胃癌患者Her-2陽性率不足20%，大部分患者無靶向治療機會[3]。因此，了解胃癌發生和轉移的分子機制，從而制訂有效的診斷和治療策略至關重要。在過去的幾十年中，隨著微陣列技術和生物信息學分析方法的廣泛應用，越來越多的腫瘤發生、發展過程中的差異表達基因(DEGs)和功能通路被發現[4]。本研究通過生物信息學方法分析GSE54129微陣列數據集篩選胃癌標本與正常胃黏膜標本之間的DEGs，隨后將DEGs導入基因本體論(GO)和基因組百科全書(KEGG)進行通路富集分析，然后構建蛋白質相互作用(PPI)網絡并篩選關鍵基因，最后進行驗證并預測調控VCAN的上游miRNAs，旨在了解胃癌發生、發展的分子機制，也為胃癌的基因靶向治療提供新思路和新途徑。

1 材料與方法

1.1芯片數據來源 搜索GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫中關于人類胃癌標本的基因芯片數據，選取并下載數據集GSE54129，芯片平臺為GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，表達數據為expression profiling by array，此芯片包含132份標本，其中有111份為胃癌組織標本，21份為正常胃黏膜組織標本。

1.2數據處理 使用GEO數據庫在線工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)[5]分析數據集GSE54129中正常胃黏膜組織標本與胃癌組織標本的有效基因數據，之后將基因芯片數據集中的探針名轉化成基因名，排除重復及無名基因，以adj.P<0.01且|log2FC|>2為標準篩選DEGs。

1.3功能富集分析 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[6]提供了一套全面的基因功能注釋工具，通過對GO分析及KEGG通路的功能富集分析，以了解DEGs背后的生物學含義。當FDR<0.05時可認為差異有統計學意義。

1.4PPI網絡構建及功能模塊分析 使用在線數據庫STRING(https://string-db.org/)[7]分析DEGs的PPI網絡，并將得到的數據以.tvs格式導出，之后導入Cytoscape軟件[8]中構建可視化PPI網絡，并使用MCODE插件對PPI網絡進行聚類分析，將得到的聚類基因再次導入DAVID數據庫，進行富集分析。

1.5關鍵基因篩選與驗證分析 使用Cytoscape中的cytoHubba軟件選取關鍵基因，采用MCC算法，提取前10個基因，然后與MCODE聚類分析得到的degree>15的模塊基因進行比對，得到重合的基因定義為候選基因，之后利用在線數據庫GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)[9]對候選基因在408份胃癌組織標本與211份正常胃黏膜組織標本中的表達水平進行對比分析，并繪制生存曲線，將與生存時間相關的基因定義為關鍵基因。

1.6組織標本RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證 分析30例未接受過術前新輔助治療的胃癌患者術后標本，其中男18例，女12例，中位年齡58歲。手術標本離體后30 min內采集組織標本，包括胃癌組織標本及正常胃黏膜組織標本(距腫瘤邊緣至少5 cm)，并立即置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中。使用Trizol試劑(碧云天生物技術有限公司，中國)從組織標本中提取總RNA。然后，加入反轉錄試劑及隨機引物(Western Biotechnology)合成cDNA。之后，加入sybr greenⅠ后進行qRT-PCR(Funglyn Biotech,Canada)檢測。反應參數包括變性程序(95 ℃下5 min)，然后是40個循環(95 ℃下15 s，65 ℃下45 s)的擴增和定量程序。每份標本都進行了一式三份的測試，每份標本都進行了熔解曲線分析，以檢查擴增的特異性。關鍵基因的引物序列見表1。以同一mRNA標本中關鍵基因與內對照GAPDH的比值確定關鍵基因的表達水平。

表1 3個基因的qRT-PCR引物序列

1.7VCAN與miRNAs關系預測 為了了解VCAN與胃癌的發生、發展機制的關系，通過Target Scan7.2(http://www.targetscan.org/)在線數據庫[10]來預測VCAN上游的調控miRNAs。

2 結 果

2.1胃癌組織與正常胃黏膜組織的DEGs 通過對基因數據集GSE54129的分析，得到了630個DEGs，包括305個上調基因和325個下調基因。使用DAVID數據庫對630個DEGs進行GO分析和KEGG通路富集分析。GO分析主要從生物過程、細胞組成及分子功能3個層面進行分析。DEGs參與的生物過程主要包括細胞外基質組織形成、細胞黏附、內胚層細胞分化、血管生成正調控、外源代謝過程等；細胞組成分析結果表明DEGs大多參與蛋白質細胞外基質、細胞外基質、細胞外區域、細胞外間隙、胞外體等組成；分子功能分析提示這些基因主要在肝素結合、視黃醇脫氫酶活性、細胞外基質結構成分方面起作用。KEGG通路富集分析結果表明，DEGs功能分析主要涉及化學致癌信號通路、細胞色素P450的外源化合物代謝信號通路、藥物代謝-細胞色素P450信號通路、視黃醇代謝信號通路和黏合斑信號通路。

2.2DEGs的PPI網絡分析 將630個DEGs輸入在線數據庫STRING中，之后將所得的數據導入Cytoscape軟件中，得到蛋白質共表達網絡，然后利用插件cytoHubba中MMC算法找出前10位的基因為TIMP1、FN1、IGFBP4、C3、FSTL1、APOE、SPP1、IGFBP7、CYR61、VCAN。

2.3PPI功能模塊分析 利用Cytoscape軟件中的MCODE插件對PPI網絡進行聚類分析，分數最高的模塊被納入。該模塊包括41個功能基因，degree>15的共19個，由高到低分別為C3、COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL4A2、CTGF、CXCR4、CYR61、FN1、FSTL1、IGFBP4、IGFBP7、MMP2、SERPINE1、SPARC、TGFB1、THBS1、THBS2、VCAN。然后將它們導入DAVID數據庫進行GO分析及KEGG 通路富集分析，結果表明聚類基因參與的生物過程主要包括細胞外基質組織形成、膠原分解代謝過程、炎性反應、細胞黏附、中性粒細胞趨化性的正調控等；細胞組成分析顯示這些基因大多參與細胞外區域、細胞外基質、細胞外間隙、蛋白質細胞外基質和內質網腔等組成；分子功能的作用主要體現在細胞外基質結構成分及肝素結合方面。KEGG通路富集分析結果表明，DEGs主要參與細胞外基質受體相互作用、蛋白質消化吸收和黏合斑等信號通路調節。

2.4關鍵基因篩選及驗證 將cytoHubba軟件計算得到的基因與MCODE軟件計算的degree>15的基因進行比對，共得到5個候選基因，分別為VCAN、IGFBP7、FSTL1、FN1、C3。之后在GEPLIA數據庫中對候選基因在408份胃癌組織標本和211份正常胃黏膜組織標本中的表達水平進行分析，發現它們在胃癌組織標本中均高表達，且差異有統計學意義(P<0.05)。最后關鍵基因的生存曲線分析結果顯示，在胃癌組織中VCAN、IGFBP7、FSTL1高表達組的生存率明顯低于低表達組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明高表達的關鍵基因與患者的不良預后關系密切，并且VCAN高表達胃癌患者與不良預后的關系更加密切。為了進一步驗證生物信息學分析的結果，采用qRT-PCR檢測了30例胃癌患者配對的胃癌組織和正常胃黏膜組織標本中3個關鍵基因(VCAN、IGFBP7和FTSL1)的mRNA水平，結果顯示3個關鍵基因在胃癌組織中均明顯上調(P<0.001)，見圖1。

注：A、B、C分別為VCAN、IGFBP7和FTSL1的表達情況；正常胃黏膜組織與胃癌組織比較；*P<0.05。圖1 關鍵基因PCR結果分析

2.5VCAN與miRNAs相互作用預測結果 使用Target Scan7.2數據庫預測出has-miR-203a-3p.1直接參與VCAN mRNA的3′UTR結合，has-miR-203a-3p.1是VCAN轉錄后的調節因子。

3 討 論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，全球大約60%新發胃癌病例來自東亞，特別是中國[1]。目前，尚缺乏胃癌早期診斷的敏感生物標志物，因此，許多胃癌患者在被發現時已處于局部晚期或伴發肝、肺等遠處轉移，從而失去臨床治愈機會[10-11]。越來越多的研究者將目光集中在尋找新的胃癌生物標志物上，期待將其用于胃癌的早期診斷和復發預測[12]。

本研究采用生物信息學方法對GEO數據庫中的111份胃癌組織標本和21份正常胃黏膜組織標本的基因數據集進行對比分析，發現共有630個DEGs，包括305個上調基因和325個下調基因。為了進一步了解DEGs的功能，本研究進行了GO分析和KEGG通路富集分析，生物過程主要涉及細胞外基質組織形成、血管生成正調控、細胞黏附等；細胞組成分析說明這些基因基本參與蛋白質細胞外基質、細胞外區域、細胞外基質等的組成；分子功能的變化主要集中在肝素結合、視黃醇脫氫酶活性、細胞外基質結構成分。KEGG通路富集分析主要涉及化學致癌信號通路等。健康人體的血管網絡生成于胚胎時期，成年后血管生成處于內源性正調節和負調節的精確平衡中[13]。當正調節加強時，則促進血管生成，參與腫瘤的發生。聚類基因分析的結果顯示，生物過程主要涉及細胞外基質組織形成、炎性反應、細胞黏附等；KEGG通路主要涉及細胞外基質受體相互作用、蛋白質消化吸收等。以上結果與另一項關于胃癌關鍵基因的生物信息學分析結果相似[14]。細胞外基質由膠原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白組成。由跨膜分子介導的細胞外基質與上皮細胞之間的相互作用可直接影響細胞黏附、遷移、分化、增殖和凋亡，這些生物過程在腫瘤的發生、發展中都起到重要作用[15]。

通過PPI網絡篩選的3個關鍵基因，在GEPIA數據庫中驗證后得到VCAN的高表達與胃癌患者不良預后關系密切的結論，與SHEN等[16]的研究結果一致。最近有研究結果提示VCAN可作為胃癌早期診斷的標志物[17]。VCAN編碼的蛋白質是大分子硫酸軟骨素蛋白聚糖，是細胞外基質的主要成分。該蛋白參與細胞黏附、增殖、遷移和血管生成，并在組織形態發生和維持中起關鍵作用[16]。既往研究發現，VCAN在創傷修復組織和腫瘤組織中高表達，其中包括腎癌、肝細胞癌、結直腸癌、膽囊癌、子宮內膜癌和胃癌等惡性腫瘤，且與腫瘤的低分化率、高轉移率及不良預后關系密切[18-22]。miRNAs是由19～25個核苷酸組成的短RNA分子，它能靶向結合mRNA的3′UTR區域來調節靶基因的轉錄后沉默[23]。本研究還預測了調控VCAN的轉錄后調節因子has-miR-203a-3p.1。有研究表明，miR-203a-3p.1促進肝癌細胞增殖和轉移[21]。過表達 miR-203a-3p可抑制Barrett食管細胞增殖[24]。miR-203a-3p通過抑制PDE4D的表達促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移[22]。

綜上所述，通過生物信息學方法分析確定了胃癌的DEGs，之后的富集分析和PPI網絡分析明確了VCAN在胃癌中的表達明顯升高，最后，預測了胃癌中has-miR-203a-3p.1可調節VCAN的表達。has-miR-203a-3p.1- VCAN軸是胃癌治療的潛在靶點。