食品中紐甜含量的不確定度評定

◎ 聶阿真，南利華，趙雪峰，李 帥，馬金華，劉定舟，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術有限公司，河南 鄭州 450001）

紐甜是一種甜味劑，但人工合成紐甜的安全性受到質疑，多數(shù)食品中紐甜的使用量都有最大限量值，如加工堅果和籽類的最大使用量為0.032 g·kg-1[1]。不同的儀器、人員、檢測環(huán)境都會對檢測結果造成一定的偏差，為了避免用“誤差”的概念表示測量結果，相關部門提出使用測量不確定度對測量結果進行評定[2]。根據(jù)《檢驗和校準實驗室能力認可準則》（CNAS-CL01：2018）[3]、《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]、《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2018）[5]和《食品安全國家標準 食品中紐甜的測定》（GB 5009.247—2016）[6]，樣品經甲酸-三乙胺-水提取液提取，C18固相萃取小柱凈化后，經C18色譜柱進行分離，采用液相色譜儀（二極管陣列檢測器）進行分析，通過保留時間進行定性，采取峰面積進行外標法定量。在實驗過程中充分考慮樣品稱量、標準儲備液配制、定容體積、樣品回收率、標準曲線擬合和測量重復性等因素，把這些因素引起的不確定度分量合成食品中紐甜含量的不確定度計算中。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

華譜S6000高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；OHAUS DV215CD電子天平（美國奧豪斯，感量0.01 mg）；JJ300A電子天平（感量0.01g）；SYU-10-200DTD超聲波清洗儀；TARGIN TECH VXIII多管渦旋振蕩器；SPE-24 Mediwax-24固相萃取裝置；BT-III水浴式氮吹儀；Perfect-20VF超純水機。

磷酸；三乙胺；乙腈（Thermo）；庚烷磺酸鈉（色譜純）；甲酸（色譜純）；甲醇（Thermo，色譜純）；紐甜標準儲備液。

1.2 色譜條件

色譜柱：Acclaim TM 120 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）（序列號：005751)；流動相：0.02%庚烷磺酸鈉溶液-乙腈；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：218 nm。

1.3 樣品的處理和測定

稱10 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加30 mL三乙胺-甲酸-水提取液提取，振蕩器上振蕩15 min，超聲波超聲20 min后，用三乙胺-甲酸-水溶液定容至50 mL，混勻，離心5 min（8 000 r·min-1），過濾，吸取10 mL的過濾液，濾液用C18小柱（3 mL，250 mg）凈化，用5 mL的甲酸-三乙胺-水溶液淋洗，舍棄所有的淋洗液，5 mL甲醇洗脫目標物，氮吹濃縮洗脫液，用甲酸-三乙胺-水提取液定容至2 mL，經0.45 μm水系濾膜過濾后，上機檢測。

1.4 工作曲線繪制

準確移取紐甜標準儲備液（500 μg·mL-1）10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL和400 μL于10 mL容量瓶中，用35%乙腈水稀釋并定容至刻度即得標準系列為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1，以樣品濃度作為曲線的橫坐標，以樣品峰面積作為曲線的縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 不確定度評定數(shù)學模型

根據(jù)一些影響紐甜不確定度的主要因素和紐甜的計算公式，建立食品中紐甜測定的不確定度評定數(shù)學模型如下：

式中：X代表待測樣中紐甜的含量，mg·kg-1；C代表上機濃度，μg·mL-1；V代表定容體積，mL；m代表樣品質量，g；R代表回收率，%；frep代表重復性系數(shù)。

2 不確定度來源分析

從樣品的數(shù)學模型、測量過程、前處理方法分析，測定食品中紐甜不確定度來源主要有稱樣引入的不確定度、定容過程中引入的標準不確定度、標準儲備液配制引入的不確定度、標準曲線擬合引入的不確定度、回收率引入的不確定度以及反復測量引入的不確定度。

3 不確定度分量的評定

3.1 稱樣引入的不確定度u(m)

本實驗稱樣量為10 g（精確至0.01 g），使用YP5002電子天平（儀器編號：ZBJC201700070），根據(jù)電子天平的校準證書，擴展不確定度為U=0.5 mg，k=2；由此得出稱樣量的標準不確定度為；引入稱樣量的相對不確定度為。

3.2 定容過程中引起的不確定度u(v)

3.2.1 容量瓶引起的不確定度

根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），在溫度為（25±1）℃的情況下，50 mL容量瓶（A級，單標線）的允許誤差為±0.05 mL，假設其為矩形分布，則50 mL容量瓶的不確定度為：

相對標準不確定度為：

3.2.2 溫度對定容體積的影響引入的不確定度

容量瓶的校準溫度為21.6 ℃，環(huán)境溫度在（20±5）℃時，50 mL容量瓶溶液所引起的體積變化為50 mL×3.4 ℃×2.1×10-4℃-1=3.57×10-2mL（水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1），假設其為矩形分布，則其引入的不確定度為：

相對標準不確定度為：

因此，定容體積引入的相對標準不確定度為：

3.3 標準儲備液配制過程引入的不確定度u(c)

3.3.1 標準物質（紐甜）純度引入的不確定度u(p)

證書上顯示純度為95.1%，其擴展不確定度為1.0%，取k=2，則其標準不確定度為，其相對標準不確定度為。

3.3.2 標準物質稱量引入的不確定度u(z)

稱量紐甜標準物質使用DV215CD電子天平（儀器編號：ZBJC201500013），根據(jù)電子天平的校準證書，擴展不確定度為U=0.12 mg，k=2；由此得出稱量標準物質的標準不確定度為；標準物質稱量引入的相對不確定度為。

3.3.3 標準物質定容引入的不確定度u(v)

（1）容量瓶引入的不確定度。稱取標準物質定容至50 mL容量瓶中，根據(jù)《常用玻璃量器》 （JJG 196—2006），在實驗室環(huán)境溫度為（25±1）℃的情況下，50 mL容量瓶（單標線，A級）的允許誤差為±0.05 mL，假設其為矩形分布，50 mL容量瓶的不確定度為：

相對標準不確定度為：

（2）溫度對標準物質定容體積的影響引入的不確定度。容量瓶的校準溫度為21.6 ℃，環(huán)境溫度在（20±5）℃時。此時容量瓶中液體的溫度與校準時溶液的溫度不同所引起的體積變化為50 mL×3.4 ℃ ×1.0×10-3℃-1=1.7×10-2mL（有機溶劑膨脹系數(shù)為1.0×10-3℃-1），則環(huán)境溫度對標準物質定容體積影響（假定為矩形分布）所引入的不確定度為：

相對標準不確定度為：

因此，定容體積引入的相對標準不確定度為：

由此得出標準儲備液配制過程引入的相對標準不確定度為：

3.4 標準曲線的擬合引入的不確定度u(q)

實驗人員對6個不同的標準工作液的濃度點進行測定，其對應濃度與峰面積見表1。

表1 不同濃度紐甜的標準工作液峰面積表

采用最小二乘法對紐甜的濃度X與其對應的峰面積Y進行線性回歸，得到紐甜標準曲線Y=aX+b= 15 534.67X-17.776 7，相關系數(shù)為R2=1.000 0。

則標準曲線擬合引入的不確定度為：

標準工作液峰面積殘差的標準差S(A)為：

標準溶液含量殘差的平方和Sxx為：

式中：a為標準曲線的斜率；b為標準曲線的截距；c0為測得樣品中紐甜的濃度mg·kg-1；p為c0測量次數(shù)；n為標準工作液的測量次數(shù)；A為標準溶液的峰面積。

由擬合標準曲線引入的相對不確定度urel(q)為：

3.5 回收率引入的不確定度urel(R)

樣品前處理過程產生的不確定度，通過計算回收率的方式來評定，并且在平均回收率與100%存在顯著性差異時，才將平均回收率作為不確定度的來源進行評估，并對實驗結果進行回收率校正，否則忽略。實驗以糕點為空白樣品添加紐甜標準物質，做6個樣品來測定紐甜的回收率，結果見表2。

表2 樣品不同添加濃度所對應的回收率表

為評估對u(R)的貢獻，必須先計算顯著因子為：

而置信概率95%下自由度15時，查得ta.f為2.13，可見t＞ta.f，說明樣品平均回收率與100%存在顯著性差異，因此回收率引入的不確定度不可以忽略。

3.6 測量重復性引入的不確定度u(frep)

在重復性條件下，對同一樣本重復測量6次，測得樣品中紐甜的含量為1.798 mg·kg-1、1.822 mg·kg-1、 1.805 mg·kg-1、1.801 mg·kg-1、1.824 mg·kg-1和 1.799 mg·kg-1。

測量的重復性以標準偏差表示，6次測量的標準偏差按貝塞爾公式計算：

本次共測量了2個樣品，其中X1=0.852，X2=0.858， 以兩次測量的平均值作為檢測結果，則本次測量平均值的標準偏差為：

兩次測量的紐甜的平均含量為0.855 mg·kg，相對標準偏差即為測量的重復性系數(shù)frep的相對標準不確定度為：

4 合成不確定度分析計算

食品中紐甜相對標準不確定度分量匯總如表3所示。

表3 相對標準不確定度分量匯總表

合成不確定度為：

由紐甜測定的平均值X=0.855 mg·kg-1和公式uc(y)=u(X)/X得：

取包含因子k=2，擴展不確定度U為：

因此，食品中紐甜不確定度的測量結果可最終表示為X=(0.855±0.108) mg·kg-1（k=2）。