葡萄蒸餾酒對小鼠急性痛風性關節炎的影響

◎ 楊江東，劉建學,2,3，韓四海,2,3，李佩艷,2,3，郭金英,2,3，羅登林,2,3

（1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 4710233；3.食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023）

急性痛風性關節炎（Acute Gouty Arthritis，AGA） 是由于人體內血尿酸含量過高導致尿酸鈉析出結晶在關節腔內，在機體遠端關節出現疼痛和炎癥反應，發作時間較快，疼痛迅速[1]。痛風一般與尿酸排泄減少而引發的高尿酸血癥直接相關，主要臨床表現為血尿酸升高，關節紅腫疼痛，皮膚溫度升高。由于尿酸過高會導致人體腎臟的負擔，嚴重者會發生關節破壞，并伴有其他疾病的病發，如高血壓及冠心病、糖尿病等[2-3]。目前臨床上干預AGA主要有兩種應對措施：對于急性發作期的治療要及時用藥物干預，進行抗炎止痛，常用藥物為吲哚美辛、雙氯芬酸[4]；對于發作間歇期要控制血尿酸水平，控制飲食，不吃高嘌呤食物（如動物肝臟、海鮮等）、高果糖食物，多吃低嘌呤食物等[5-6]。

葡萄是葡萄科葡萄屬木質藤本的一種植物，營養價值很高，多吃可以增強脾胃，除此之外葡萄還具有抗炎癥和抗血小板凝聚、抗癌癥等功能[7-8]。研究表明葡萄中白藜蘆醇具有顯著的降血尿酸和抗炎活性，葡萄中所含槲皮素可以明顯降低痛風模型大鼠足趾腫脹度[9-11]。葡萄蒸餾酒是葡萄發酵后經蒸餾而成的一種酒精濃度高于原發酵產物的酒精飲料，同樣具有一定的保健效果[12]。研究表明葡萄酒中所含嘌呤含量很少，極低于相同質量黃酒及白酒中的嘌呤量[13]。研究表明飲用葡萄酒不會增加痛風發作的風險，葡萄酒可以降低痛風大鼠的炎癥反應，但目前較少有人研究葡萄蒸餾酒與痛風之間的關系[14-15]。本課題組前期對葡萄蒸餾酒的飲用人群進行調查，部分飲用者反饋葡萄蒸餾酒適量飲用可以緩解痛風的疼痛。因此本實驗預計通過葡萄蒸餾酒灌胃及AGA造模來探究葡萄蒸餾酒對AGA小鼠關節腫脹度和血清生化指標的影響，初步討論產生干預效果的原因，為下一步葡萄蒸餾酒中微量成分對AGA小鼠的干預研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF級）6～8周齡雄性昆明小鼠96只，22～38 g，購自河南科技大學實驗動物中心。實驗動物許可證號：SYXK（豫）2020-0008，小鼠自由攝食飲水，于河南科技大學食品與生物工程學院動物飼養室分籠飼養，飼養室溫度（20±2）℃，濕度50%～55%，每天12 h光照12 h黑暗飼養7 d。本實驗在確保實驗可行性的同時減少實驗動物的數量，所有實驗結束后，小鼠均以頸椎脫臼法處死，動物尸體進行無害化處理，本實驗遵循實驗動物的生物倫理學要求。

1.2 試劑與材料

葡萄蒸餾酒（46°、52°、60°），河南九朝雅宴酒業有限公司提供；無水乙醇、乙醚（分析純）天津市德恩化學試劑有限公司提供；吲哚美辛（99%）、尿酸鈉（98%），上海麥克林生化科技有限公司提供；4%多聚甲醛固定液，廣州賽國生物科技有限責任公司提供；丙二醛試劑盒（Malondialdehyde，MDA）（批號：20211203）、超氧化物歧化酶試劑盒（Superoxide Dismutase，SOD）（批號：20211122）、過氧化氫酶試劑盒（Catalase，CAT）（批號：20211202），南京建成生物工程研究所提供；小鼠腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）試劑盒（批號：202112046）、小鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IF-1β）試劑盒（批號：202112046）上海鈺博生物科技有限公司提供。

1.3 儀器與設備

BSA1245型分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司產品；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；單聯萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司產品；JE502型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產品；D3024R型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；752G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫療器械有限公司產品；XW-80A型渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品；電子數顯卡尺，桂林量具刃具有限責任公司產品；Multiskan型多功能酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司產品。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠的分組與給藥

將96只雄性昆明小鼠適應性培養7 d，飼養過程中，每日觀察小鼠形態行為，精神狀態。適應性飼養7 d后將小鼠隨機分為12組，每組8只，分別為空白對照組、模型組、葡萄蒸餾酒（46°、52°、60°）低中高（1 mL·kg-1、2 mL·kg-1、4 mL·kg-1）劑量組、吲哚美辛組（0.075 mg·kg-1）。空白對照組及模型組灌胃蒸餾水，葡萄蒸餾酒各個劑量組分別灌胃對應劑量的葡萄蒸餾酒，吲哚美辛組灌胃吲哚美辛溶液，每天給藥1次，灌胃體積為10 mL·kg-1，連續灌胃7 d。

1.4.2 小鼠的造模及指標的測量

（1）模型的制備。小鼠連續灌胃7 d進行造模。造模前用游標卡尺記錄每只小鼠右足掌的厚度和寬度，空白對照組用20 μL無菌生理鹽水注射小鼠右側后肢踝關節。模型組和各個劑量葡萄蒸餾酒組及吲哚美辛組：用無菌注射器將20 μL尿酸鈉晶體混懸液（含1 mg尿酸鈉晶體）注射小鼠右側后肢踝關節。注射時應注意無菌操作。

（2）模型具體制備過程。小鼠在密閉的容器內用乙醚進行麻醉，時刻關注小鼠的狀態，防止小鼠乙醚麻醉過量導致小鼠死亡，小鼠麻醉后進行固定，選擇小鼠的右后肢進行操作，用碘伏浸潤的脫脂棉簽對小鼠足趾部進行消毒，用注射器吸取20 μL尿酸鈉溶液在右后足足側遠端進行注射，防止因注射部位太近導致注射液的漏出，注射時以對側關節囊鼓起為注入成功標準[16]，注射完成后對小鼠注射部位按壓止血，用碘伏進行消毒，防止傷口感染發炎，觀察造模后小鼠右后足趾部有無出現明顯腫脹，有無液體溢出[17]。

1.4.3 小鼠血清指標的測量

小鼠處死前12 h禁食不禁水，小鼠采用眼球采血，采血前將小鼠胡子剪去并對小鼠眼眶周圍皮膚進行消毒，防止采集的血液溶血，采血后小鼠脊椎脫臼處死，尸體無害化處理。采集后的血液室溫靜置1 h，在高速冷凍離心機中以4 ℃，3 000 r·min-1條件下離心15 min，分離上層血清，采用試劑盒檢測方法用紫外可見分光光度計及多功能酶標儀檢測各組小鼠血清CAT、SOD活性以及MDA、TNF-α、IF-1β含量[18]。操作過程嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

1.4.4 小鼠關節腫脹度的測量及關節滑膜切片的制備

尿酸鈉晶體混懸液注射于小鼠右側后肢踝關節后，用游標卡尺測量小鼠注射尿酸鈉溶液后2 h、4 h、6 h、8 h和12 h的雙側后肢足掌厚度及寬度并記錄，按公式（1）計算足趾腫脹度。在注射后24 h處死小鼠，取下小鼠右側后肢踝關節，以踝關節為中心取長度為0.5 cm的組織為測定樣本，用無菌生理鹽水沖洗后，用4%多聚甲醛溶液固定，于室溫下固定24 h，選擇脫鈣液乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）于室溫下進行脫鈣處理，脫鈣2周后，石蠟包埋，沿矢狀面進行切片，之后對切片進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠踝關節滑膜組織病變及炎性細胞浸潤情況。

式中：X為足趾腫脹度；mm；A1為給藥后足趾厚度，mm；A2為給藥后足趾寬度，mm；B1為給藥前足趾厚度，mm；B2為給藥前足趾寬度，mm。

1.5 數據分析

數據應用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，各組結果以±s的形式表示，多組間比較首先采用單因素方差分析，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠關節腫脹度的影響

各組別小鼠注射尿酸鈉后不同時間足趾腫脹度如表1所示，造模后12 h小鼠足趾腫脹度如圖1所示，小鼠在構造AGA模型后，關節處會出現明顯腫脹，關節腫脹度會顯著增加[19]。由于空白對照組注射的為生理鹽水，因此由于空白對照組小鼠關節的吸收作用小鼠足趾腫脹度會迅速下降，空白對照組4 h、6 h、 8 h、12 h的腫脹度相較2 h明顯下降，而模型組下降幅度沒有空白對照組大，且模型組12 h的腫脹度相較空白對照組12 h極顯著升高（P＜0.001），這證明小鼠AGA模型構造成功。圖1為各小鼠造模后12 h的腫脹度，圖中可以發現吲哚美辛組及46°低劑量組小鼠足趾腫脹度相較模型組顯著下降（P＜0.05），說明46°低劑量葡萄蒸餾酒可以顯著降低模型小鼠足趾腫脹度，但效果不如吲哚美辛。46°中劑量也有下降的趨勢但不顯著（P＞0.05），而52°中劑量組和60°低劑量組則會使小鼠足趾腫脹度顯著或極顯著升高（P＜0.05）或（P＜0.01），說明52°中劑量和60°低劑量葡萄蒸餾酒可以升高模型小鼠足趾腫脹度，剩余的組別與模型組相比雖也有上升或下降的趨勢但是無顯著差異（P＞0.05）。

表1 12 h內葡萄蒸餾酒對AGA小鼠足趾腫脹度的影響表（單位：mm，n=8）

圖1 造模后12 h小鼠足趾腫脹度圖

2.2 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠體重的影響

各組別小鼠不同時間體重如表2所示，小鼠體重是表達小鼠健康程度的重要指標[18]。經統計學分析，實驗后一周小鼠體重相較實驗前小鼠體重出現了明顯增加，但各組增加的量沒有顯著差異（P＞0.05）， 而在后續AGA造模過程中，各組的實驗小鼠體重均減少，各組之間體重變化不顯著（P＞0.05），這表示葡萄蒸餾酒在灌胃小鼠的過程中對小鼠體重無顯著性影響。但小鼠在實驗后一周造模時，各組小鼠體重均下降，這說明小鼠在構造AGA模型的過程中會導致小鼠食欲減退，體重下降，但各個組別之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 實驗小鼠體重變化表（單位：g，n=8）

2.3 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠血清SOD、CAT活性的影響

各組別小鼠血清中SOD和CAT活性水平如表3所示，SOD和CAT是參與痛風的兩種關鍵酶，研究發現部分藥物可以通過提高這兩種酶的活性從而提高抗氧化活性發揮治療痛風性關節炎的功效[20-21]。由 表3可知，52°中劑量組與60°高劑量組，兩組別相較于模型組超氧化物歧化酶活性顯著下降（P＜0.05），證明高酒精度的葡萄蒸餾酒可能會使AGA小鼠炎癥反應加劇，葡萄蒸餾酒由低劑量到高劑量，SOD水平依次降低，這說明隨著葡萄蒸餾酒劑量的升高，會降低AGA小鼠血清SOD的活性。表3中各個劑量組葡萄蒸餾酒小鼠血清CAT活性均較模型組升高，其中52°低劑量組顯著升高（P＜0.05）和60°低、高劑量組及吲哚美辛組極顯著升高（P＜0.01），表3中可以明顯看到隨著葡萄蒸餾酒度數和劑量的升高，CAT活性顯著升高，這表明該葡萄蒸餾酒中含有能升高小鼠血清CAT活性的微量成分。

表3 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠血清SOD、CAT的影響表（單位：U·mL-1，n=8）

2.4 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠IL-1β及TNF-α含量的影響

各組別小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平如圖2、圖3所示，當小鼠機體發生AGA時，小鼠體內的IL-1β含量以及TNF-α含量會顯著上升[22]，IL-1β是炎癥反應中非常重要的炎癥因子，經常分布在血液或者組織液中，它可以刺激巨噬細胞分泌炎癥因子，從而調節炎癥反應[23]。TNF-α同樣是痛風性關節炎中常見的炎癥因子，當機體發生感染、炎癥時，TNF-α水平會增高。研究也發現小鼠構造AGA模型成功后，會使小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平增高[24]。由圖2、圖3可知，模型組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05），這證明AGA小鼠模型構造成功。研究發現吲哚美辛可以抑制小鼠血清中TNF-α和IL-1β的生成從而降低小鼠的足趾腫脹度[25]，圖2、圖3中吲哚美辛組TNF-α和IL-1β水平降低或顯著降低（P＜0.05），結果符合文獻的報道，TNF-α和IL-1β參與慢性疼痛的發生和發展，這表明吲哚美辛可以降低關節炎的疼痛，這與常識一致，也與文獻報道的一致[26]。此外，圖2中除了60°高劑量組除外，其余各劑量組均可以不同程度的降低小鼠血清中的IL-1β含量，其中46°中劑量組可以顯著降低血清中IL-1β含量（P＜0.05），但隨著酒精度和劑量的升高，降低效果越來越差，這表明酒精濃度和劑量越低，降低效果越好。由圖3知，46°低、高劑量組、60°低、中劑量組都可以降低模型小鼠血清中的TNF-α含量，結合圖2的葡萄蒸餾酒對AGA模型小鼠血清IL-1β含量的影響，可以得出低劑量葡萄蒸餾酒可能通過降低模型小鼠血清中的IL-1β和TNF-α水平從而降低AGA小鼠足趾炎癥及疼痛。

圖2 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠IL-1β含量的影響圖

2.5 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠血清MDA含量的影響

各組別小鼠血清中丙二醇（Malondialdehyde，MDA）含量如圖4所示，MDA的含量可以衡量機體細胞受氧化脅迫的程度[18]。在痛風患者中，MDA的含量顯著高于健康人群[27]。由圖4可知，模型組相較空白對照組，血清中MDA含量極顯著升高（P＜0.01），這可以側面證明小鼠AGA模型構造成功。在構造小鼠AGA模型過程中，除了空白組注射生理鹽水外，剩余組別均在小鼠關節腔內注射了尿酸鈉晶體。由 圖4可知，模型組、葡萄蒸餾酒各組別及吲哚美辛組相較空白對照組血清MDA含量升高（P＜0.05），除60°中劑量組外其余各組別MDA含量與模型組無顯著差異（P＞0.05），這說明葡萄蒸餾酒干預AGA的過程并非通過血清中MDA來實現的。

圖3 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠血清中TNF-α含量的影響圖

圖4 葡萄蒸餾酒對AGA小鼠血清MDA含量的影響圖

2.6 小鼠關節滑膜組織染色觀察

各組別小鼠關節滑膜切片如圖5所示，由圖5可知正常組小鼠關節組織完整，關節腔內干凈，關節表面光滑，關節間組織無充血水腫，滑膜細胞無增生，沒有炎癥發生。模型組關節腔內組織炎癥明顯，組織表面由滑膜增生，關節腔內有炎性滲出物，周圍軟組織有炎性細胞浸潤。46°低、中劑量組及吲哚美辛組對比模型組滑膜細胞增生明顯減輕，充血情況也同樣減少，52°低、中劑量組及60°低劑量組關節腔內充血嚴重，可見滑膜充血腫脹至關節腔內，這表明52°低中劑量組及60°低劑量組小鼠關節腫脹嚴重，結果與圖1小鼠造模后12 h小鼠足趾腫脹度吻合，各組小鼠關節滑膜切片表明46°低中劑量組葡萄蒸餾酒可以緩解AGA小鼠炎癥反應。高劑量組的葡萄蒸餾酒會使小鼠關節滑膜損傷加重，所示結果與圖1所示一致。

3 結論

本文中所用的AGA模型構造方法較為經典，采取對小鼠關節腔內注射尿酸鈉溶液的方式，使小鼠關節腔因為外來異物的損傷作用及尿酸鈉的破壞作用出現關節炎癥，構造時間短，構造方便，并且根據需要可以選擇預防性給藥或治療型給藥，此方法經常被用于抗痛風物質的篩選上[28]。文中采用預防性給藥的方法，先用葡萄蒸餾酒及相應藥物對小鼠進行灌胃，而后對小鼠進行AGA模型造模，通過測量注射尿酸鈉溶液后小鼠關節腫脹度以及血清內相應酶活性判斷葡萄蒸餾酒對AGA小鼠的干預效果。

由實驗結果可知，46°低劑量的葡萄蒸餾酒可以顯著抑制小鼠AGA足趾腫脹度（P＜0.05），原因可能是葡萄蒸餾酒中微量成分降低小鼠血清中IL-1β及TNF-α水平實現的，但是隨著酒精度和劑量的提高，52°中劑量組和60°低劑量組則會使小鼠足趾腫脹度顯著或極顯著升高，原因可能是酒中乙醇含量的升高，乙醇代謝產生乙酸競爭性抑制尿酸的排泄，乙醇代謝過程中會快速消耗三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），也會使尿酸產生增加，最終導致小鼠體內的尿酸升高；當外部注射尿酸鈉溶液時，小鼠體內的尿酸含量水平較高，尿酸鈉不能及時溶解，故52°中劑量組和60°低劑量組使得AGA模型小鼠關節腫脹度顯著升高。

通過對小鼠體內酶活性水平的統計分析發現，52°中劑量組和60°高劑量組小鼠SOD水平顯著降低，說明這兩組小鼠的關節腫脹度可能會因為酶活性的降低而導致炎癥加劇，觀察圖1小鼠足趾腫脹度發現這兩組小鼠足趾腫脹度相較模型組顯著增加，而CAT活性水平與葡萄蒸餾酒存在劑量相關性，這說明該葡萄蒸餾酒中含有提高小鼠血清CAT活性的微量成分。通過對小鼠關節滑膜切片可以看出，46°低、中劑量的葡萄蒸餾酒可以明顯減少關節滑膜的充血面積，減輕炎癥反應。其抗炎機制可能是與葡萄蒸餾酒升高小鼠體內CAT活性以及降低小鼠血清中IL-1β及TNF-α水平相關。52°各個劑量組關節滑膜充血嚴重，故52°各個劑量組關節腫脹度相較其他組別明顯偏高。60°各劑量組可能由于乙醇升高尿酸作用和小鼠體內酶活性以及炎癥因子的多重作用下導致60°高劑量組小鼠腫脹度反而相較52°各劑量組下降，但仍與模型組無顯著性差異（P＞0.05），且大于空白組。具體機理有待更深層次的實驗的進一步研究。

綜上所述，適量飲用46°葡萄蒸餾酒可以升高AGA模型小鼠血清中CAT活性，降低AGA模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量，減輕關節滑膜損傷，從而降低AGA模型小鼠關節腫脹度及減輕疼痛。但由于葡萄蒸餾酒中成分復雜，機體代謝過程具有多種途徑，因此葡萄蒸餾酒中具體功效成分及相關代謝機理還需要進一步研究及分析。