雞肉中三種喹諾酮藥物殘留檢測的 不確定度評定

◎ 張丹鶴，周瑩瑩，劉定舟，朱欣欣，崔倩倩，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術有限公司，河南 鄭州 450001）

喹諾酮類，又稱吡酮酸類，是一類合成抗菌藥。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、組織穿透力強、價格低廉以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，被廣泛應用于畜禽多種疾病的預防和治療[1]。恩諾沙星、環丙沙星和沙拉沙星是家禽養殖中的常用藥，使用率較高[2]。但是，如果在畜禽養殖過程中不合理用藥，或者未嚴格按照休藥期用藥，易導致畜禽產品的藥物殘留超標，對人類健康帶來安全隱患。在農產品質量安全監管中，不確定度顯得極為重要，尤其是當檢測結果處于限量附近時，通過方法的不確定度的評估，可以對檢測結果的準確性進行評價，以驗證樣品是否合格[3]。本研究對實驗室應用《食品安全國家標準 動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB 31658.17—2021）測定雞肉中恩諾沙星、環丙沙星和沙拉沙星含量進行了不確定度分析，找出影響結果的主要分量，在實際操作中對這些分量進行重點控制，有利于在獸藥殘留檢測工作中對檢測結果作出更準確的判定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Thermo Fisher TSQ Quantis/Vanquish超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；20～200 μL移液槍，100～1 000 μL移液槍（Dragon）；0.000 01 g感量分析天平（美國奧豪斯Ohaus）；0.01 g感量分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；50 mL容量瓶。

1.2 材料與試劑

標準物質：恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星，均由Dr. Ehrenstorfer GmbH生產；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，由Thermo Fisher公司生產；其他試劑均為分析純；實驗用水為一級水。

標準儲備液配制：用十萬分之一天平稱量5 mg的標準物質，用0.03 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解并定容至50 mL，配制成濃度為100 μg·mL-1的標準溶液。

1 μg·mL-1混合標準工作液的配制：分別用移液器取0.1 mL濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

0.1 μg·mL-1混合標準工作液的配制：用移液器取1 mL濃度為1 μg·mL-1的混合標準工作液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3 樣品處理

提取凈化：稱取試樣1 g（準確至±0.01 g），按照GB 31658.17—2021的測定步驟進行處理，收集洗脫液，45 ℃水浴氮氣吹干。加入復溶液1.0 mL，渦旋1 min溶解殘余物，14 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定[4]。

1.4 標準曲線溶液的制備

精密量取混合標準工作溶液適量，分別加入7份經提取和凈化的空白試樣殘渣中，45 ℃水浴氮氣吹干，加入復溶液1.0 mL渦旋溶解殘余物，配制成濃度為 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、 50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的基質匹配系列混合標準溶液，0.22 μm濾膜過濾。

1.5 樣品測定

將配制的基質匹配標準曲線和樣品溶液，用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀進行測定。以基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，求回歸方程和相關系數，用外標法計算試樣中藥物的殘留量。計算公式如下：

式中：C為測定樣液中被測組分的濃度，ng·mL-1；V為定容體積，mL；m為樣品重量，g；X為樣品中待測組分的含量，μg·kg-1；f為稀釋倍數。

1.6 數學模型的建立

根據上述結果計算公式，在實驗過程中f為1，是一個常數，因此不確定度評定中此參數可忽略不計。由于實驗過程步驟多，包括提取和凈化等多個步驟，很難對各環節進行評定，具有不可控性，可通過加標回收率等對處理樣品過程中的不確定度進行評定。綜合得到雞肉中3種喹諾酮類藥物（恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星）的質量分數計算的不確定度評定數學模型如下：

式中：X為試樣中藥物殘留量的數值，μg·kg-1；C為樣品溶液中被測組分的濃度，μg·mL-1；m為樣品重量，g；V為試樣中最終定容體積的數值，mL；Rrec為回收率校正因子。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量的主要來源分析

根據實驗過程及數學模型分析，3種喹諾酮類藥物（恩諾沙星、環丙沙星和沙拉沙星）殘留測定的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品溶液中被測組分的濃度、最終定容體積和樣品前處理過程（通過加標回收率來反映）等。被測組分的濃度受標準儲備液、標準曲線配制、校準曲線擬合等的影響較大。下面以恩諾沙星為例計算測量不確定度，然后以同樣方法計算環丙沙星、沙拉沙星的測量不確定度。

2.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

本實驗中稱量樣品1.00 g，所用天平精密度為0.01 g。校準證書給出的擴展不確定度U1=0.01 g，k=2。標準不確定度=0.01/2=0.005 g，相對不確定度urel(m)=0.005/1=0.005。

2.3 標準儲備液配制引入的相對標準不確定度urel(b)

主要由標準物質的純度、標準物質稱量和標準儲備液定容過程引入。

2.3.1 標準物質純度引入的相對標準不確定度urel(p)

3種喹諾酮類標準物質的純度、不確定度和包含因子見表1。標準物質證書給出的是擴展不確定度，屬于正態分布，置信概率P=95%，包含因子k=2，是B類評定，標準物質引入的相對標準不確定度為：

根據上述計算公式，求得環丙沙星的相對不確定度為0.007 10，沙拉沙星的相對標準不確定度為0.010 30。

表1 3種標準物質的來源、純度及擴展不確定度表

2.3.2 標準物質稱量引入的相對標準不確定度

標準儲備液配制時，恩諾沙星稱取5.01 mg，環丙沙星稱取5.42 mg，沙拉沙星稱取5.15 mg。十萬分之一天平校準證書給出的擴展不確定度U2=0.05 mg，k=2，是B類評定。以恩諾沙星為例，標準不確定度，相對標準不確定度。

根據上述計算公式可得，環丙沙星標準物質稱量時引入的相對標準不確定度為0.004 61，沙拉沙星標準物質稱量時引入的相對標準不確定度為0.004 85。

2.3.3 標準儲備液定容引入的相對標準不確定度

根據《標準玻璃量器檢定規程》（JJG 20—2001）[5]， 50 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.016 mL， 容量瓶引入的不確定度為B類不確定度，符合矩形分布，包含因子，標準不確定度，容量瓶體積引入的相對標準不確定度。

儲備液配制過程中所用的溶劑為0.03 mol·L-1氫氧化鈉水溶液，水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1[6]。 容量瓶在20 ℃校準，實驗室溫度范圍為（20±3）℃，水的溫差效應引起的體積變化為50 mL×3 ℃×2.1× 10-4℃-1=0.031 5 mL，溫度導致體積變化符合矩形分布，溫度對體積影響引入的標準不確定度0.018 2，相對標準不確定度=0.000 364。

2.3.4 計算合成相對標準不確定度

以恩諾沙星為例，標準儲備液配制過程引入的相對標準不確定度：

經計算，環丙沙星標準儲備液配制引入的不確定度為0.008 48，沙拉沙星標準儲備液配制引入的不確定度為0.011 40。

2.4 標準曲線引入的不確定度

2.4.1 移液器使用引入的不確定度

根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）[7]，用200 μL移液器移取200 μL的允許誤差是±3.0 μL，移取100 μL的允許誤差是±2.0 μL，移取20 μL的允許誤差是±0.8 μL。因標準中未規定50 μL的允許誤差，移取50 μL的允許誤差取最大容量允許誤差±4%計算，為±2.0 μL。

以200 μL移液器吸取100 μL溶液為例計算移液器引入的不確定度，允許誤差是±2.0 μL，取均勻分布，標準不確定度，引入的相對不確定度urel(vy1)=1.15/100=0.011 5，由此計算方法得到200 μL移液器移取其他體積的不確定度urel(vx)，見表2。

表2 200 μL移液器引入不確定度表

2.4.2 混合標準工作液配制過程引入的不確定度

（1）1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度。10 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.006 mL，容量瓶引入的不確定度為B類不確定度，符合矩形分布，包含因子，標準不確定度，容量瓶體積引入的相對標準不確定度。標準工作液配制過程中所用的溶劑為甲醇，甲醇的膨脹系數為1.1×10-3℃-1。容量瓶在20 ℃校準，實驗室溫度范圍為（20±3）℃，甲醇的溫差效應引起的體積變化為10 mL×3 ℃×1.1×10-3℃-1=0.033 mL，溫度導致體積變化符合矩形分布，溫度對體積影響引入的標準不確定度，相對標準不確定度。根據表2，200 μL移液器吸取100 μL標準儲備液引入的不確定度為0.011 5， 則1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度為：

（2）0.1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度。根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）[7]，用1 000 μL移液器移取1 000 μL的允許誤差是±10 μL，相對不確定度=0.005 77。參照1 μg·mL-1混合標準工作液不確定度評定分析過程，經計算得到0.1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的相對標準不確定度為urel(b2)=0.006 09。

2.4.3 標準曲線溶液配制的不確定度urel(L)

標準曲線各濃度點配制的不確定度由所用混合標準工作液、移液器吸取一定體積的標準工作液以及用移液器吸取1 mL定容引入。吸取標準溶液時移液槍的使用過程見表3。以100 ng·mL-1濃度點的配制過程為例，相對不確定度：

按照此分析方法，經計算得200 ng·mL-1、50 ng·mL-1、20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、5 ng·mL-1和2 ng·mL-1的不確定度分別為0.015 7、0.026 5、0.012 1、0.014 2、0.024 6 和0.024 6，計算時取標準曲線溶液的最大不確定度 值0.026 5。

表3 標準曲線配制過程表

2.4.4 線性擬合引入的不確定度

將標準溶液分別注入液相色譜串聯質譜儀進行測定，進樣量為5 μL，得到恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星標準曲線線性回歸相關系數R2分別為0.999 6、0.999 3、0.999 9，因此線性擬合引起的不確定度可以不做考慮。

2.5 樣品復溶定容引起的不確定度

提取過程中，氮氣吹干后，最后用1 mL移液槍吸取1 mL復溶液復溶。用1 000 μL移液器移取1 000 μL 的允許誤差是±10 μL，按矩形分布計算，量取1 mL復溶液的相對標準不確定度為：

2.6 處理樣品過程中的不確定度

樣品前處理過程的不確定度通過添加樣的回收率和精密度進行評定，屬于A類評定[8]。取雞肉空白基質，加入適量混合標準溶液，得到含量為20 μg·kg-1（與測試樣品濃度相當）的空白加標雞肉樣品，每個濃度6個平行，按照實驗方法進行處理。6次測定的回收率、回收率的標準偏差見表4。恩諾沙星的相對標準不確定度。經計算可得環丙沙星和沙拉沙星的相對標準不確定度分別為0.020 7、0.029 1。

表4 添加樣回收率及其標準偏差表

2.7 合成相對標準不確定度的計算

合成相對標準不確定度計算公式為：

各檢測項目的相對標準不確定度結果見表5。

表5 各檢測項目合成相對標準不確定度表

2.8 報告結果與表示

報告中雞肉中恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星測定結果X測分別為20.40 μg·kg-1、17.80 μg·kg-1、18.90 μg·kg-1。

u(X)=urel(X)×X，取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×u(X)，k=2，測定結果為X=X±U，k=2，具體結果見表6。

表6 各項目最終結果表

3 結論

分析各不確定度分量的評定數據可以得出，在實驗室按照《食品安全國家標準 動物性食品中四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB 31658.17—2021）測定雞肉中恩諾沙星、環丙沙星和沙拉沙星含量時，影響不確定度的主要環節是標準儲備液配制、標準曲線和回收率。在日常檢測工作中，需要重視這些環節，使用高純度標準物質，保證標準溶液的準確度，盡量將回收率控制在較高水平。在標準溶液配制過程中，相較容量瓶，使用移液器引入的不確定度較大。因此，實驗室要定期對移液器進行校準，必須要正確操作、定期維護，保證移液器的準確。