基于網絡藥理學和分子對接研究明目地黃丸治療糖尿病視網膜病變的分子機制

常迪，徐曉鶴

（中國醫科大學 1.附屬第一醫院藥學部配液中心，沈陽 110001；2.附屬盛京醫院眼科，沈陽 110004）

糖尿病是最常見的內分泌系統疾病［1］。2020年數據顯示，我國糖尿病發病率約為9.7%。糖尿病患者持續的血糖激活可誘發機體產生諸多病理性改變，并繼發相關并發癥［2-3］。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見的并發癥，嚴重可導致失明。近年來，常規西藥聯合中成藥治療DR的療效逐漸得到證實。明目地黃丸基于六味地黃丸加味組成，全方共奏具益氣養陰活血和補益肝腎之效［4］。然而，明目地黃丸治療DR的分子機制仍不明確。中藥網絡藥理學是一門新興學科，借助數學、計算機科學和網絡科學等多學科方法，系統、科學、全面地探索藥物治療疾病的潛在分子機制［5］。本研究擬采用網絡藥理學分析明目地黃丸的有效成分、作用靶點和通路等信息，并通過核心蛋白和藥物有效成分的分子對接，從分子層面深入探討明目地黃丸治療DR的臨床價值，亦為后續臨床推廣提供更多依據。

1 材料與方法

1.1 明目地黃丸成分檢索

采用中藥系統藥理學分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）檢索明目地黃丸組方中蒺藜、白芍、當歸、菊花、枸杞子、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸（制）、熟地黃的化學成分，篩選條件為類藥性（drug-like，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%。通過檢索國內外文獻查找石決明（煅）［6］的主要化學成分，并通過BATMAN-TCM數據庫進行化合物主要靶標蛋白檢索。

1.2 基因芯片篩選

以“diabetic retinopathy”作為關鍵詞，從基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）下載DR患者人源基因芯片（GSE60436）。采用R語言（3.6.3）對所選取芯片數據進行標準化處理。

1.3 DR差異基因的篩選和處理

采用limma包依據差異基因的上調和下調倍數篩選差異基因，條件為P＜ 0.05。并借助pheatmap包繪制差異基因表達的火山圖。

1.4 明目地黃丸成分-靶點網絡的構建

將DR相關靶點和組方中相關藥物的主要預測靶點進行合并取交集。借助Cytoscape3.7.2軟件進行靶點網絡分析（分析采用“Network Analyzer”工具進行）。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建和關鍵靶點篩選

借助STRING平臺（https：//string-db.org/）構建明目地黃丸的潛在抗DR靶點及靶點的PPI網絡圖。參數設置為＞0.9作為評分條件，蛋白種類選擇“Homo sapiens”，并通過Cytoscape3.7.2軟件的“Cytohubba”插件進行明目地黃丸抗DR核心靶點篩選。

1.6 基因本體（gene oncology，GO）及京都基因和基因組（kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG）富集分析

借助R語言中的“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”和“org.Hs.eg.db”包對交集基因進行GO功能富集分析，并深入明確明目地黃丸中藥活性成分的靶點蛋白在基因功能中的作用。再次使用上述R包進行KEGG功能富集分析，深入探討明目地黃丸中藥活性成分的靶點在通路中的作用。

1.7 明目地黃丸核心成分與關鍵靶基因的分子對接

從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載小分子Quercetin、luteolin、naringenin的結構式，再從PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載核心蛋白結構域的pdb格式，運行 Vina 腳本進行分子結合能計算以及分子對接結果展示，同時運行Discovery Studio 2019尋找對接位點并計算柔性結合的LibDockScore，若結合能＜0說明配體與受體可自發結合，當Vina結合能≤-5.0 kcal·mol-1以及Lib-DockScore能找到對接位點說明兩者形成穩定對接，對配體-受體復合物進行分子對接結果3D、2D展示，以評價生物信息分析預測的可靠性［7］。

1.8 體外實驗

配制明目地黃丸溶液，并分為低劑量、中劑量和高劑量組。分別取4.5 g、9 g和13.5 g藥丸溶于5 mL 75%乙醇，待完全溶解后置于離心管（母液），并放置于4 ℃冰箱保存。分別取500 μL母液加入500 μL完全培養基，均配制為1 mL/質量的溶液。

本研究采用高糖/低氧環境培養人視網膜色素上皮細胞系ARPE-19模擬DR的代謝狀態。模型建立方法：將細胞置于培養基中（含10%胎牛血清），待細胞融合達90%時，向培養基中加入氯化鈷（終濃度調至100 μmol/L）和葡萄糖（終濃度調至25 μmol/L）。

采用Western blotting法檢測PI3K-Akt 信號通路相關蛋白表達。采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液提取細胞的總蛋白。然后，使用bicinchoninic acid protein assay kits試劑盒對蛋白質進行定量，用SDSPAGE分離膠分析，轉移到PVDF膜上，并用5%的脫脂牛奶封閉。4 ℃下用一抗孵育過夜，以GAPDH為內參，然后用相應的二抗孵育2 h，最后用增強化學發光試劑進行顯影，采用Image J軟件對實驗結果進行分析。

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DR相關差異基因表達分析

通過對GEO芯片數據庫的基因芯片進行挖掘分析，獲取DR患者和正常群體差異表達基因，見圖1。

圖1 DR相關差異基因表達分析Fig.1 Analysis of differential gene expression related to diabetic eye disease

2.2 明目地黃丸組方中藥材主要化合物有效成分篩選結果

以DL≥0.18，OB≥30%為篩選條件，在TCMSP中檢索蒺藜、白芍、當歸、菊花、枸杞子、澤瀉、茯苓、山藥、牡丹皮、山茱萸（制）、熟地黃，并通過文獻閱讀明確石決明（煅）的主要化學成分，借助BATMAN-TCM進行標靶蛋白篩選，條件為：Score cutoff≥20，P＜ 0.05，共篩選出39個化學物。

2.3 明目地黃丸有效成分-DR的網絡構建及分析結果

將組方中261個靶點和9 945個DR差異表達基因取交集，得到160個交集基因。

2.4 明目地黃丸與DR相關標靶PPI網絡（圖2）

圖2 網絡核心靶點Fig.2 The network between core targets

利用STRING數據庫將明目地黃丸160個DR相關構建標靶PPI網絡，該網絡共160個節點，173條相互作用關系，平均節點度值為5.15。將STRING平臺中構建的PPI網絡導入Cytoscape3.2.1中進行后續核心靶點篩選，借助CytoNCA插件，并以Network（NC）、LAC、Eigenvector（EC）、BC（betweenness）、DC（degree）和CC（closeness）作為打分標準進行核心靶點篩選，篩選標準為同時滿足6項標準中大于中位值的基因。經過3次篩選最終得到核心靶點14個。

2.5 GO富集分析

以P值作為篩選條件選取了明目地黃丸和DR交集基因影響最大的前30個功能信息，見圖3。

圖3 GO富集功能分析氣泡圖Fig.3 Bubble charts of GO enrichment function analysis

2.6 KEGG富集分析（圖4）

圖4 KEGG富集分析氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment analysis bubble chart

利用KEGG富集對明目地黃丸和DR交集基因進行分析，選取影響最大的前30條通路。包括脂質和動脈粥樣硬化、人類巨細胞病毒感染、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、化學致癌-受體激活、丙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、愛潑斯坦-巴爾病毒感染和癌癥中的蛋白多糖通路，提示明目地黃丸通過以上多條通路發揮治療DR的作用。

2.7 分子對接

分子對接結果顯示，Quercetin、luteolin均與核心蛋白RB1形成穩定對接，其結合能遠低于-5.0 kcal·mol-1，naringenin與核心蛋白AKT1形成穩定對接，其結合能遠低于-5.0 kcal·mol-1。小分子Quercetin、luteolin、naringenin與核心蛋白RB1、AKT1的 受體-配體進行柔性對接，結果顯示DS能找到對接位點，且小分子naringenin與核心蛋白AKT1形成的對接模型LibDockScore均＞100。核心蛋白RB1、AKT1與小分子Quercetin、luteolin、naringenin能形成穩定的對接模型，見表1，圖5。

表1 分子對接結果Tab.1 Molecular docking results

圖5 分子對接模型Fig.5 Molecular docking models

2.8 蛋白表達

Western blotting結果顯示，高劑量組PI3K、Akt蛋白相對表達量顯著高于中劑量組、低劑量組和空白對照組（F=18.681，P＜ 0.001），差異有統計學意義。見圖6。

圖6 Western blotting 結果Fig.6 Western blotting results

3 討論

中醫認為糖尿病歸于“眩暈”“心悸”“消渴”等范疇［8］。治療應以養肝、滋陰和明目為主。明目地黃丸方中白芍滋陰養血、柔肝；熟地黃益精填髓、補血滋陰；石決明（煅）明目去翳，平肝清熱；蒺藜活血祛風、平肝解郁；山茱萸（制）澀精固脫、補益肝腎；當歸補血活血；牡丹皮活血化瘀；菊花平肝明目、散風清熱；山藥補腎澀精、生津益肺；枸杞子益精明目、滋補肝腎；澤瀉清濕熱；茯苓健脾寧心。

本研究結果顯示，MDM2、AKT1、RUNX2、JUN、HSP90AA1、CCND1、CDK4、CDK1、MYC、TP53、HIF1A、MAPK1、RB1和CDKN1A這14個基因為作用于疾病的核心基因。分子對接結果顯示，槲皮素、木犀草素和柚皮素與RB1、AKT1具有較好的結合活性。動物實驗研究［9］證實，槲皮素可通過抑制視網膜新生血管的形成進而促進視網膜病變發生。CHAI等［10］研究證實，槲皮素可抑制DR，其機制可能與抑制血紅素加氧酶-1的表達有關。YANG等［11］研究顯示，木犀草素可通過調節NLRP/NOX4信號通路預防大鼠視網膜病變。AI-DOSARI等［12］研究發現，視網膜組織的氧化應激反應激活是促進糖尿病患者眼底病變發生的重要機制，而柚皮素可通過抗凋亡、抗氧化和抗糖尿病等特性防止DR的發生。明目地黃丸方中存在多種藥物活性成分可對DR治療發揮積極作用，進一步分析明目地黃丸的KEGG信號通路，主要涉及病毒感染、炎癥相關和內分泌系統。考慮內分泌系統紊亂是導致糖尿病發生和病情惡化的重要病理機制，而機體微炎癥激活被證實是進一步導致眼部病變發生的重要因素。楊敏等［13］報道，PI3KAkt信號通路是治療DR的重要靶點，且PI3K-Akt信號通路是“補腎活血法”治療DR的重要靶點。基于KEGG通路富集分析和DR相關研究體外實驗進展，本研究進一步選取高糖/低氧環境培養ARPE-19來模擬DR的代謝狀態，并通過基于不同濃度明目地黃丸干預后，采用Western blotting法檢測細胞中PI3KAkt信號通路中p-PI3K和p-Akt蛋白的相對表達水平，結果顯示，高劑量組p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達水平顯著低于中劑量、低劑量和空白對照組，中劑量顯著低于低劑量和空白對照組，證實明目地黃丸可有效抑制ARPE-19細胞中PI3K-Akt信號通路的表達。

綜上所述，本研究通過中醫網絡藥理學方法深入探討了明目地黃丸治療DR的潛在分子機制，為臨床治療提供理論依據。