初發噬血細胞綜合征患兒外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平及預后分析

于程，李長鋼 ， 劉超

(1.青島市婦女兒童醫院，山東 青島 266000；2.深圳市兒童醫院，廣東 深圳 518000)

噬血細胞綜合癥是一種固有免疫網絡系統異常引發的、以“炎性因子風暴”為特征的臨床綜合征[1-2]。其病因多樣、發病機制復雜、病情進展迅速，而又無特異性癥狀和體征，易引起發熱、肝脾腫大、血細胞減少、血清鐵蛋白升高、纖維蛋白原降低等，特別是與重癥感染所致的多臟器功能衰竭、彌散性血管內凝血等有相似的臨床表現，往往被延誤診斷，病死率極高。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是人體內固有免疫系統通過模式識別受體及病原微生物的病原相關分子，誘導天然免疫反應的重要成份生成，在機體免疫機制中起著非常重要作用。在已發現的TLRs中，TLR1 能夠識別來自細菌的三乙酰脂肽；TLR2、4能分別識別來自細菌、病毒、自體等來源的脂蛋白及脂多糖，且只在髓源性細胞(單核巨噬細胞)中表達；TLR3、7、8、9 可以識別病毒、細菌感染細胞中的核酸成分。相關研究發現，TLR2、3、4 在其發病機制中作用顯著，尤其在多種感染相關疾病，但是目前尚缺乏TLR在噬血細胞綜合癥患兒發病過程起何種作用研究。尤其是TLR2、4對各種感染相關疾病發病中起重要作用，而作為唯一依賴包含TLR結構域的β干擾素誘導性銜接蛋白(TRIF)信號通路的TLR3，不僅能作為研究病毒感染相關疾病重要分子，而且有助于進一步發現其與TLR4在TRIF信號通路中協同/抑制作用。目前，噬血細胞綜合癥的診斷及預后預測主要依靠非特異性臨床和實驗室監測指標，而隨著近年來對噬血細胞綜合癥的研究逐漸加深，臨床研究發現并不能完全依靠噬血細胞綜合癥診斷標準HLH-2004。本研究旨在探討初發噬血細胞綜合征患兒外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平及其對預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年8月至2019年7月深圳市兒童醫院收治的18例初發噬血細胞綜合征患兒為研究組，18名同期體檢健康兒童為對照組。對照組中，男性10名，女性8名；年齡(3.58±1.59)歲。研究組中，男性14例，女性4例；年齡(2.62±1.32)歲。研究經本院倫理委員會審核批準，受試者家屬知情同意。兩組對象性別、年齡等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。研究組再根據預后分為存活組(n=4)與死亡組(n=14)。納入標準：(1)符合診斷標準[3]并確診的患兒；(2)年齡<12歲。排除標準：(1)既往有惡性血液、免疫性及其他相關病史；(2)入院前有給予激素、丙種球蛋白大量沖擊治療史、創傷或手術史。

1.2 方法

采集所有對象的外周血，檢測以下指標：(1)TLR2、TLR4表達：選擇細胞表面染色法對外周血CD14單核細胞進行檢測，取流式管2支，并標記為1、2號，分別置入肝素抗凝外周血100 μL，然后加入不同含量的單克隆抗體(管1∶5 μL IgG1 k-PE、CD14-FITC、IgG1 k-APC；管2∶5 μL TLR2 PE、CD14-FITC、TLR4-APC)，混勻后于4 ℃環境中避光存放30 min，每管分別加入1×RBC Lysis Buffer 2 mL，混勻后于室溫環境中避光存放10 min，紅細胞完全裂解后，300 g離心5 min，棄上清液，將預冷過的Flow Cytometry Staining Buffer加入各管中(每管2 mL)，旋轉混勻，300 g離心5 min，棄上清液，重復上一步后，保留管底的100 μL液體，然后分別于每管中置入Flow Cytometry Staining Buffer 150～200 μL，上機，分別收集細胞1×104個，結束后選擇DivaVer 6.1.3軟件對TLR2、TLR4的相對比例進行分析。(2)TLR3表達：選擇細胞內染色法對外周血CD14單核細胞進行檢測，取流式管兩支，并標記為1、2號，分別置入肝素抗凝外周血100 μL及CD14-eFlour450 5 μL，旋轉混勻后于避光環境中存放10 min，紅細胞完全裂解后，300 g離心5 min，輕棄廢液，分別于每管中置入Flow Cytometry Staining Buffer 2 mL，同上離心、棄液，重復上一步，保留管底的100 μL液體，放于旋勻器上，將100 μL IC Fixation邊旋邊加入，需要注意的是槍頭禁止碰到管壁，防止濺出，完成后放于室溫遮光條件下孵育20 min，分別置入1×Permeabilization Buffer 2 mL，500 g離心5 min，棄廢液，重復上一步，保留管底的100 μL液體，于每管中置入Normal Rat Serum、Normal Mouse Serum各3 mL，吹打混勻，于室溫條件下孵育15 min，于1號管中置入IgG2a-FITCE 5 μL，2號管中置入TLR3-FITC單克隆抗體5 μL，均混勻，之后于室溫遮光條件下孵育30 min，完成染色后，分別置入1×Permeabilization Buffer 2 mL，500 g離心5 min，棄上清，重復上一步后，保留管底的100 μL液體，然后上機檢測。(3)白介素1β(IL-1β)，干擾素α(IFN-α)，干擾素β(INF-β)，腫瘤壞死因子α(TFN-α)表達：收集所有研究對象清晨空腹狀態下靜脈血3 mL，于室溫環境中等待30 min后，選擇酶聯免疫吸附法進行檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究組與對照組外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平比較

研究組外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對照組外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平比較

2.2 研究組與對照組血漿IL-1β、IFN-α、INF-β、TFN-α表達水平比較

研究組IL-1β，INF-β，TFN-α表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組對象IFN-α表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 研究組與對照組IL-1β，IFN-α，INF-β，TFN-α表達水平比較

2.3 存活組與死亡組外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平比較

死亡組患兒外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 存活組與死亡組外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平比較

3 討論

正常情況下，病毒/細菌感染后巨噬細胞分泌IL-12等，刺激自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)活化，誘導細胞毒效應，進而清除病毒/細菌，防止過度刺激活化免疫細胞，而噬血細胞綜合癥情況下，NK細胞和CTL細胞毒功能缺陷，抗原刺激下持續活化和增殖，CTL產生大量細胞因子，尤其是IFN-α，后者進一步刺激巨噬細胞持續活化，分泌大量IL-12和其他細胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18和TNF )。IL-12又刺激CTL擴增，產生INF-α，大量炎性細胞因子堆積而發生“炎性因子風暴”[4]。對組織細胞造成損傷，引起一系列臨床表現，但是炎性因子風暴產生的具體機制尚未明確。近年來對噬血細胞綜合癥的研究越來越多，但起病過程并無特異性，因此往往容易與其他疾病混淆，延誤診斷時機，急需通過研究明確其發病機制，為早期診斷及治療提供新思路。

TLRs作為近些年研究熱點，在國內外多項研究[5-7]發現，TLR在免疫調節中發揮重要作用并得到廣泛認可。TLR是一類由胞外區、跨膜區及胞質區組成的I型跨膜蛋白。其胞外區為N端，由19-25個含有多個亮氨酸的重復序列構成，它能夠識別病原微生物表面的脂多糖、胞壁酸等。TLR跨膜區為含半胱氨酸的結構域[8]。TLR在人體細胞中廣泛分布，但其表達數量在不同細胞中存在較大差異。研究[9-12]發現，TLR2、3、4結腸癌細胞中過度表達，TLR2、3等受體在傳染性單核細胞增多癥等 EB 感染患兒中顯著表達，而在膿毒癥等感染中檢測到TLR2、4也過度活化。并且TLR3也發現與哮喘、感染性休克、類風濕性關節炎等多種炎癥及自身免疫性疾病有關[13-15]。本研究收集的18例噬血患兒中，14為EB病毒性噬血細胞綜合癥，3 例明確為細菌感染，1例病因不明。TLR2能夠識別包括來源于細菌、病毒、真菌以及自體損傷等產生的脂蛋白等；TLR4 除能夠識別革蘭氏陰性菌內毒素，還可分別通過識別病毒感染后的損傷相關分子模式以及與病毒衣殼蛋白結合而活化。本實驗觀察結果發現，噬血細胞綜合癥患兒外周血單細胞 TLR2、3、4 表達水平較健康兒童明顯較高(P<0.05)，說明TLR2、3、4 的活化在噬血細胞綜合癥發病中起重要作用。

目前已證實TRAF及核因子κB等信號分子激活，可誘導 IL-1、TNF-α、IFN-α等細胞因子大量表達[16-18]。在正常情況下，當病毒/細菌等感染機體后，單核巨噬細胞系統會分秘IL-12等，刺激NK細胞及CTLs發揮細胞毒效應，而噬血細胞綜合癥中患兒體內NK細胞及CTLs 的細胞毒效應減弱，導致大量細胞因子聚集無法發揮正常免疫作用，最終產生炎性因子風暴。為進一步證明此現象以及研究細胞因子的產生與噬血細胞綜合癥中TLR2、3、4活化及下游信號傳導情況的關系，本研究通過對噬血細胞綜合癥患兒及健康兒童血清檢測發現，噬血細胞綜合癥患兒IL-1β、TNF-α、IFN-α濃度均高于健康對照組(P<0.05)。可能正是TLR2、3、4的活化，導致前炎性細胞因子基因表達水平升高，尤其是IFN-α，其對巨噬細胞刺激作用明顯，刺激巨噬細胞進一步活化，這種惡性循環，使更多IL-1，IL-6，IL-12等細胞因子在體內大量堆積[19]。由此可見，TLR2、3、4的大量活化，可能是導致噬血細胞綜合癥患兒體內炎性細胞因子風暴的發生的重要原因。另外，噬血細胞綜合癥患兒的IFN-α表達水平較健康兒童，升高不明顯(P>0.05)，可能與TLR-TRIF通路活化受到抑制，最終導致I型干擾素基因表達受限有關。可能正是TRIF依賴通路激活受限，干擾素分泌不足，導致機體不能及時有效清除病毒等感染，而持續的刺激不斷誘使TLR2、4激活，產生IL，TNF等大量細胞因子，導致機體免疫失衡。其中IL-1大量產生后易引起發熱和惡病質，而TNF-α和IFN-α等會抑制骨髓造血功能是導致血細胞減少，這種免疫紊亂最終導致噬血細胞綜合癥一系列臨床表現[20]。本研究對患者的預后分析結果顯示，死亡初發噬血細胞綜合征患兒的TLR2、3、4表達水平較存活患兒來說均較高(P<0.05)，說明TLR2、3、4同噬血細胞綜合征的發展息息相關，同時能夠在一定程度上預測預后狀態。由此推測，初發噬血細胞綜合征患兒在感染細菌或病毒后，活化了大量的TLR2、3、4，且它們分別特異性識別侵入的革蘭陽性菌、革蘭陰及陽性菌、葡萄球菌，從而導致炎癥因子風暴，進而參與噬血細胞綜合征的發展。

綜上，初發噬血細胞綜合征患兒外周血單核細胞TLR2、3、4及血漿IL-1β，INF-β，TFN-α表達水平明顯較高，且外周血單核細胞TLR2、3、4表達水平能夠判斷初發噬血細胞綜合征患兒的預后狀況。