miR-219a-5p 在胃癌中的甲基化調控及生物學功能研究

羅 敏章 帆王利民李紅霞卿克勤

(成都市第一人民醫院檢驗科,成都 610000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康。 根據國際癌癥研究機構2020 全球最新癌癥數據顯示:中國胃癌的發病人數約為47.8 萬(占全球43.9%),死亡人數約為37.3 萬(占全球48.6%) ,發病率和死亡率均位列第三位[1]。

胃癌患者的高死亡率主要是由于腫瘤的復發和轉移,DNA 甲基化調控在胃癌的發生過程中具有重要意義[2],而腫瘤相關的microRNA 研究揭示出許多在腫瘤發生發展、耐藥以及預后等方面起重要作用[3]。 miR-219a-5p 已被報道在多種類型的腫瘤細胞中發揮重要調控作用:miR-219a-5p 抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[4];miR-219a-5p 上調抑制了黑色素瘤的生長和轉移并增強了黑色素瘤細胞的化學敏感性[5];miR-219a-5p 抑制上皮性卵巢癌細胞增殖,遷移和侵襲[6];miR-219a-5p 增強膽囊癌進展[7]。 但miR-219a-5p 及其甲基化調控在胃癌的發生發展中的機制尚不清楚。 本研究發現miR-219a-5p 在胃癌患者組織中受甲基化調控而出現表達水平明顯下調,通過體外實驗進一步驗證過表達miR-219a-5p 后能明顯抑制細胞增殖和遷移侵襲的能力,提示在胃癌發生發展過程中發揮抑癌基因的作用,為胃癌的診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人胃癌細胞株MGC-803(中國醫學科學院基礎研究所細胞中心)。

1.1.2 組織

胃癌組織及其相應癌旁組織共110 例(均來自北京市腫瘤醫院2013~2016 年手術切除后凍存組織標本)。 已通過成都市第一人民醫院(成都市中西醫結合醫院)倫理審查(2020 年KT 第006 號)。

1.2 主要試劑與儀器

1640 培養基和胎牛血清(Hyclone 公司);熒光定量PCR 試劑盒(北京全式金生物技術有限公司);Lipofectamine 2000 細胞轉染試劑(Invitrogen 公司);miR-219a-5p-mimic(上海吉瑪生物技術有限公司);亞硫酸氫鹽轉化試劑盒EpiTect@Bisulfite kit(Qiagen 公司,貨號58694I);兔抗人P-caspase-3 抗體(Cell Signaling 公司,貨號8664L);CCK-8(Cell Counting Kit-8)(日本株式會社同仁化學研究所Dojindo,貨號CK04);凋亡試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences 公司,貨號579563)。 Transwell 小 室(Minipore 公 司, 貨 號PIMP12R48);熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad IQ5);流式細胞儀(美國Coulter Flow c6)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量RT-PCR

文中所有引物的設計均根據Primer Premier 5 軟 件 設 計。 miR-219a-5p 逆 轉 錄 引 物: 5 ’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACAGAATT-3’; U6 逆 轉 錄 引 物: 5’- AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3 ’; miR-219a-5p 定 量PCR 上 游 引物:5’-CAGCTGATTG TCCAAACGC-3’;miR-219a-5p 定量PCR 下游引物:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6 定量PCR 上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’;U6 定量 PCR 下 游 引 物: 5 ’-ACGCTTCACGAATTT GCGTGTC-3’。 定量PCR 反應條件為:95℃ 5 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,40 個循環,72℃ 10 min。 均設復孔3 個。 IQ5 熒光定量PCR 儀進行PCR 檢測。 利用IQ5 自帶分析軟件導出相對表達值進行統計學分析。

1.3.2 甲基化特異性PCR 及甲基轉移酶抑制劑5’aza-2’-脫氧胞苷(5’ AZa-CDR)處理細胞

提取腫瘤組織及癌旁組織DNA,通過亞硫酸氫鹽轉化試劑盒處理后進行甲基化特異性PCR。 CPG島預測及甲基化引物設計利用在線軟件Methprimer (http:/ /www.urogene.org/methprimer/index1.html)及Primer Premier 5 軟件:甲基化上游引物:5’-TTGATTGTTTAAACGTAATTTTCGA-3’;甲基化下游引物:5’-CTAAAAACACACCTAAATCCCGAT-3’;非甲基化上游引物:5’-TTGATTGTTTAAATGTAATT TTTGA-3’;非甲基化下游引物:5’-CCTAAAAAC ACACCTAAATCCCA-3’。 甲基化特異性PCR 采用Touchdown PCR 的方法,反應條件如下:95℃ 5 min,95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 40 s,每個循環降0.6℃,10 個循環后,52℃ 30 s,72℃ 40 s,35 個循環,72℃ 10 min。 用5、15、30 μmol/L 的不同濃度梯度的5’ AZa-CDR 和組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A (TSA)處理胃癌細胞MGC-803 后,分析處理前后miR-219a-p 的表達變化情況。

1.3.3 細胞轉染和分組處理

MGC-803 細胞株培養于含10%胎牛血清的1640 完全培養基,37℃、5% CO2。 將MGC-803 細胞接種于6 孔板,待細胞融合度達到70%~80%時(貼壁24 h 內),脂質體轉染方法:每孔100 μL 的無血清培養基中稀釋20 μL mimic,另外100 μL 的無血清培養基中稀釋Lipofectamine 2000 轉染試劑3 μL,各靜置5 min 后混合再靜置20 min;將上述混合液加入含細胞的6 孔板中,終體積為1 mL 無血清無雙抗1640 培養基,6 h 后更換新鮮完全培養基2 mL。轉染后繼續培養48 h,收獲細胞提取RNA 和蛋白質。 把轉染control-mimic 和miR-219a-5p-mimic 的胃癌細胞MGC-803 命名為control-mimic(對照組)和miR-219a-5p-mimic(miR-219a-5p 過表達組)。 把沒有轉染的細胞命名為un-treated(未處理組)。

1.3.4 組織標本與細胞總RNA 提取

按TRIzol 說明書操作提取組織或者細胞總RNA。 總RNA 通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性。

1.3.5 檢測細胞增殖

取轉染后24 h 的MGC-803 細胞,重新鋪于96孔板中,相同實驗組各設4 個復孔。 每孔鋪5000 個細胞,分別設0、24、36、48、72 h 5 個時間點,檢測450 nm 與630 nm 雙波長下的光密度值(optical density, OD) ,制作時間增殖曲線,所有操作均按CCK-8 試劑盒說明書操作。

1.3.6 檢測細胞凋亡

取轉染后48 h 的胃癌細胞系MGC-803 用預冷的PBS 洗滌2 次,用Bind buffer 重懸,經PE Annexin V 和7-Amino-actinomycin (7-AAD)雙染后1 h 內送流式細胞儀檢測。

1.3.7 Western blot 檢測p-caspase-3 蛋白的表達

提取細胞(約1×106個)總蛋白,并將20 μg 總蛋白于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)中電泳并轉移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶室溫封閉2 h,將膜封閉于含有相應一抗的抗體稀釋液中(1 ∶ 1000) ,4℃過夜。 次日用TBST(tris buffered saline with 0.05% Tween-20)緩沖液洗膜3次,每次10 min,然后加入相應的二抗(1 ∶1000),室溫溫育1 h,TBST 洗膜3 次后顯影。 內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶重組蛋白(recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 一抗(1 ∶2000),二抗(1 ∶5000)。 用增強化學發光法顯色,X光片曝光顯影。

1.3.8 遷移和侵襲實驗

接種細胞前1 d 在Transwell 小室上準備基質膠,基質膠與預冷的無血清1640 按1 ∶7 的比例以總量32 μL 鋪室面(做腫瘤遷移實驗則不需要此步);取不含血清的培養液制備單細胞懸液(每毫升2.5×105個)400 μL 加入上室中;在下室即24 孔板內加入600 μL 含20% FBS 的1640 培養液。 將24孔板置于37℃、5% CO2細胞培養箱內,培養24 h 后用濕棉簽檫去膜上面未穿過膜的細胞,無水乙醇固定20 min 后結晶紫染色,染色完畢后將小室自然風干,用手術刀片沿壓痕將小室膜輕輕切下,置于載玻片上在顯微鏡下觀察、計數。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件進行數據統計,實驗數據以平均數±標準差(±s)表示,各組均數通過方差齊性檢驗后,兩組間的比較采用t檢驗,P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-219a-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中的差異表達

通過實時熒光定量PCR 我們分析了110 例胃癌患者癌組織(C)及癌旁組織(N) 標本中的表達情況,數據用Log1.5 (C/N)表示,有72 例患者miR-219a-5p 的表達水平在癌組織中低于癌旁組織,另外38 例患者表達上調(見圖1A)。 miR-219a-5p 在癌組織中的表達值為(0.769±0.95),癌旁組織表達值為(2.114±5.10),差異具有統計學意義(P=0.0063)(見圖1B)。

2.2 miR-219a-5p 在胃癌組織中的表達與臨床病理分期分型的相關性

本研究分析了110 例胃癌患者中miR-219a-5p的表達與臨床病理因素之間的相關性,其表達與年齡性別等無統計學差異,與臨床病理分型及分期有一定的相關性,miR-219a-5p 的表達隨著腫瘤分期的增加而進一步降低,差異具有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 miR-219a-5p 表達和胃癌患者臨床病理特征的關系(n=110)Table 1 Relationship between miR-219a-5p expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients

2.3 miR-219a-5p 的表達受表觀遺傳學調控

為了明確miR-219a-5p 在胃癌細胞中表達下調的原因,本研究首先進行生物信息學分析,利用MethPrimer 軟件預測miR-219a-5p 上游區域的CpG島(圖2A)。 采用MSP 檢測11 對miR-219a-5p 表達下調組和9 對表達上調組的胃癌組織和癌旁組織中miR-219a-5p 的甲基化狀態。 本研究發現miR-219a-5p 基因啟動子區域的高甲基化比例在miR-219a-5p表達下調組(72.7%,8/11)比表達上調組的甲基化比例(55.6%,5/9)更高(圖2B)。 此外,MGC-803經5’ AZa-CDR 處理后,miR-219a-5p 的表達上調(圖2C),TSA 的聯合處理排除無其他表觀遺傳調控的影響。 綜上所述,這些數據表明,miR-219a-5p 在胃癌中由于上游區域甲基化而表達下調。

注:A: 患者miR-219a-5p 在癌組織中的相對下調表達比例;B: miR-219a-5p 在癌組織及癌旁組織中的表達值分布情況。 與癌旁組織相比,??P<0.01。圖1 miR-219a-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中的表達情況Note.A, Relative down-regulated expression ratio of miR-219a-5p in cancer tissues of patients.B, Distribution of expression values of miR-219a-5p in cancer tissues and adjacent tissues.Compared with adjacent noncancerous tissues group, ??P<0.01.Figure 1 Expression of miR-219a-5p in gastric cancer tissues and adjacent tissues

注:A: MiR-219a-5p 上游區域的CpG 島; B: MiR-219a-5p 基因啟動子區域的甲基化情況;C: MGC-803 細胞經5’ AZa-CDR 處理后miR-219a-5p 的表達情況。 DMSO:二甲基亞砜;AZA:5-氮雜-2-脫氧胞嘧啶(5’ AZa-CDR);TSA:組蛋白脫乙酰酶曲古抑菌素A;C:癌組織;N:癌旁組織;M:甲基化引物PCR 產物;U:未甲基化引物PCR 產物。 與DMSO 處理組相比, ?P<0.05。圖2 miR-219a-5p 的表達受甲基化表觀遺傳學調控Note.A, CpG island in the upstream region of miR-219a-5p.B, Methylation in the promoter region of miR-219a-5p gene.C, Expression of miR-219a-5p in MGC-803 cells treated with 5’ AZa-CDR.DMSO, Dimethyl sulfoxide.AZA, 5-aza-2-deoxycyfidine (5’ AZa-CDR).TSA, Histone deacetylase Trichostatin A.C, Cancer tissues.N, Adjacent noncancerous tissues.M, Methylated primer PCR product.U, Unmethylated primer PCR product.Compared with DMSO treatment group, ?P<0.05.Figure 2 Expression of miR-219a-5p is regulated by methylation epigenetics

2.4 過表達miR-219a-5p 抑制胃癌細胞MGC-803的增殖能力

通過脂質體轉染模擬體mimic 使MGC-803 細胞過表達成功,過表達組miR-219a-5p 表達水平升高近9583 倍,見圖3A。 CCK-8 結果顯示,與未處理組(un-treated) 和對照組(control-mimic)相比,過表達組(miR-219a-5p-mimic)的細胞增殖能力明顯受到抑制,72 h 時間點的CCK-8 檢測值(OD450和OD630)分別是(1.83±0.02)、(1.78±0.02)、(1.18±0.06),差異具有統計學意義(P<0.001)(見圖3B)。

2.5 過表達miR-219a-5p 促進胃癌細胞MGC-803的凋亡

流式細胞儀結果顯示,與un-treated 組和controlmimic 組相比,miR-219a-5p 過表達組MGC-803 細胞的凋亡比例明顯增加,見圖4A 所示,control-mimic 組與miR-219a-5p 過表達組的早期凋亡比例分別是(26.6±0.94)%和(51.6±1.74)%,晚期凋亡比例分別是(11.3±1.21)%和(9.6±0.95)%,早期凋亡率明顯增高(P<0.05)。 Western blot 結果顯示,MGC-803 細胞轉染miR-219a-5p-mimic 48 h 后,凋亡相關蛋白caspase-3 的表達水平明顯比對照組的表達水平高,GAPDH 為內參,見圖4B。

圖4 MiR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-219a-5p overexpression on MGC-803 cell apoptosis

2.6 過表達miR-219a-5p 抑制胃癌細胞MGC-803遷移和侵襲能力

圖5A、5B 所示,Transwell 小室遷移實驗結果顯示,過表達miR-219a-5p 組高倍鏡每視野平均穿膜細胞數明顯少于un-treated 組和control-mimic 組,差異具有統計學意義(P<0.05) 。 圖5A、5C 所示,在有基質膠的transwell 小室侵襲實驗發現,miR-219a-5p 過表達組高倍鏡每視野平均穿膜細胞細胞數同樣明顯少于un-treated 組和control-mimic 組,差異具有統計學意義(P<0.05)。 以上實驗表明,miR-219a-5p 能減弱胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

注:A: MGC-803 細胞轉染mimic 后miR-219a-5p 過表達成功;B: miR-219a-5p 過表達后抑制MGC-803 細胞的增殖。 與對照組相比,???P <0.001。圖3 miR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞增殖的影響Note.A, Overexpression of miR-219a-5p successfully transfected mimic into MGC-803 cells.B, Overexpression of miR-219a-5p inhibited the proliferation of MGC-803 cells.Compared with control-mimic group,???P <0.001.Figure 3 Effect of miR-219a-5p overexpression on the proliferation of MGC-803 cells

注:A: MiR-219a-5p 過表達后抑制MGC-803 細胞的遷移和侵襲;B: 3 組高倍鏡每視野平均穿膜細胞數。 與對照組相比, ?P<0.05。圖5 MiR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞遷移和侵襲能力的影響Note.A, Overexpression of miR-219a-5p inhibited the migration and invasion ability of MGC-803 cells.B, The average number of transmembrane cells per field of view of the three groups of high magnification.Compared with control-mimic group, ?P<0.05.Figure 5 Effect of miR-219a-5p overexpression on the migration and invasion ability of MGC-803 cells

3 討論

胃癌患者發病一般無明顯癥狀,常與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似,由于缺乏有效的早期診斷的腫瘤分子標志物,大多數胃癌患者確診時已是進展期,而患者預后高度依賴腫瘤臨床分期,早期胃癌患者術后5 年生存率可達90%,而進展期胃癌的5 年生存率卻低于30%[8],可見胃癌的及時診斷和預后評估對于優化治療策略至關重要,傳統的各種血清抗原標志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、胃蛋白酶原(PG)等的檢測僅通常被用作表明癌癥風險的特征[9-10]。 因此,尋找胃癌新的腫瘤分子標志物是臨床對胃癌精準診療的迫切需求。 miRNA 通過對靶mRNA 的降解或翻譯抑制,從而發揮其對靶基因表達的轉錄后調控作用,在腫瘤進展和轉移過程中發揮重要的調節作用[11-12]。 Li 等[13]研究發現血清miR-17-92 能很好的區分早期胃癌患者和健康對照組,具有致癌潛力,其中miR-20a-5p 在診斷胃癌時受試者工作特征曲線下面積(AUC)較高,大于0.95,敏感性和特異性均大于90%,可見miRNA 可以很好的作為胃癌診斷的潛在分子標志物。

在本研究中,通過實時熒光定量PCR 方法手段發現miR-219a-5p 在胃癌患者癌組織中呈現普遍低表達情況,本課題組下一步研究計劃就是收集胃癌患者血清標本,檢測血清標本中miR-219a-5p 的含量,分析是否能為篩選胃癌早期診斷標志物提供參考價值。 為了探索miR-219a-5p 為什么會出現癌組織表達下調,我們分析了miR-219a-5p 所跨越的基因組啟動子區域序列,利用MethPrimer 在線軟件(http:/ /www.urogene.org/methprimer/index1.html)我們發現存在CpG 島,miRNA 表達的失調是癌癥的發生、發展的重要特征,miRNA 的表達具有組織和時空特異性,并受到表觀遺傳機制調控,CpG 島的高甲基化具有沉默基因表達的作用[14]。 miR-320a在胃癌組織中受DNA 甲基化調控,在癌組織中表達普遍下調,并可抑制腫瘤進展[15]。 我們的實驗結果也提示在胃癌組織中顯著低表達的miR-219a-5p 很可能受甲基化的表觀遺傳調控。 同時我們發現miR-219a-5p 的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而降低,研究結果表明其表達的改變可能在胃癌的進展中扮演一定角色。

miRNA 在胃癌治療、監測復發和判斷預后方面也有著廣闊的應用前景,多項研究表明miRNA 與胃癌的轉移、復發和耐藥等緊密相關[16-18]。 本研究利用模擬體miR-219a-5p-mimic,在胃癌細胞系MGC-803 中成功過表達miR-219a-5p 后,可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進凋亡,這說明了miR-219a-5p 可能是胃癌發生發展過程中一種重要的抑癌miRNA,調控胃癌細胞增殖、凋亡、轉移等生物特性過程,雖然具體機制還有待進一步研究,但為臨床治療胃癌提供了新的靶點。 Wang 等[17]報道miR-454 在胃癌組織和細胞系中顯著下調,miR-454的低表達與淋巴結轉移、浸潤深度和TNM 分期呈正相關,并提出miR-454 可能負調控結合絲裂原活化蛋白激酶1 而在胃癌中發揮抑癌基因作用,抑制胃癌細胞的增殖和侵襲,誘導了細胞的凋亡。 由此可見,miRNA 作為基因的重要調控因子,可望成為胃癌精準治療的最有前景的新靶點。

Ji 等[18]研究發現miR-374a-5p 在胃癌患者血清中明顯高表達且與患者進展及預后不良相關,且裝載了miR-374a-5p 抑制劑的外泌體能夠逆轉奧沙利鉑體內外抗性,顯著抑制腫瘤的生長,這些發現提示,體外抗miR-374a-5p 可能是一種潛在的胃癌耐藥治療方法,也說明利用外泌體的轉運功能以及較好生物相容性的特性在治療腫瘤中顯示出優勢,這將為miRNA 靶向治療開拓一片廣闊領域。 如果將目的miRNA 裝載至外泌體過表達抑癌基因,其抑制腫瘤活性的效果可能將更明顯[19]。