槲皮素治療大鼠肺纖維化的作用及相關(guān)機(jī)制研究

薛 蘭毛春迎王 慧王守福張爭(zhēng)輝郭新慶?

(1.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,山東 菏澤 274000;2.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系,山東 菏澤 274000)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是臨床上棘手的疾病,無有效治療方法,致死率高,患者一般最終因呼吸衰竭而死亡。 該病是多因素引起的嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,在西醫(yī)上認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)在肺組織間質(zhì)過度沉積,降解減少而引起的病理改變。在中醫(yī)學(xué)上屬于“肺痿”、“肺痹”范疇,認(rèn)為可能與肺腎虧虛、氣血凝滯、痰瘀痹阻肺絡(luò)有關(guān)。 目前中藥對(duì)于肺纖維化的治療具有一定的作用,能夠有效緩解病情,減輕肺纖維化的程度,減少患者痛苦[1]。槲皮素(quercetin, QUE)是一種廣泛存在于自然界中的多羥基黃酮醇類化合物,不僅富含在柴胡、桑寄生、銀杏葉等中藥中,就連日常生活中的蘋果、西蘭花、卷心菜等也有。 藥理研究證明槲皮素具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌等作用[2],相關(guān)實(shí)驗(yàn)也說明了槲皮素抗肺纖維化的分子機(jī)制,有可能是通過調(diào)控Smad7 信號(hào),緩解TGF-β 誘導(dǎo)的小鼠肺泡II 型上皮細(xì)胞NIH3T3 纖維化[3],但槲皮素抗肺纖維化的分子機(jī)制尚未得到透徹研究,為了進(jìn)一步闡明槲皮素對(duì)肺纖維化的作用機(jī)制,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討槲皮素抗肺纖維化的分子機(jī)制,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年3~5 周齡雄性SPF 級(jí)SD 大鼠50 只,重量190~210 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0009],質(zhì)量合格證號(hào):11400700045968,飼養(yǎng)于本院屏障級(jí)動(dòng)物室[SYXK(魯)2020-0013]。 所有實(shí)驗(yàn)操作遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)管理規(guī)定,經(jīng)菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校進(jìn)行倫理審批HZYZ2019-0381),遵循3R 原則。

1.1.2 細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞由中南大學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.2 主要試劑與儀器

Click-iT?Plus TUNEL assay 試劑盒(貨號(hào):C10618)購自Invitrogen 公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):C0105)購自碧云天;Masson Stain Kit Masson 染色試劑盒(貨號(hào):60532ES58)購自上海翊圣生物科技有限公司;IL-1β(貨號(hào):ab13847)、TNF-α(貨號(hào):ab202068)、TGF-β1(貨號(hào):ab64715)、α-SMA(貨號(hào):ab5694)、GAPDH(貨號(hào):1056)一抗購自美國Abcam 公司;HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國 Santa Cruz 公司; NOX4 (貨號(hào): E-ELR0015c)、NF-κB(EEL-R0019)、P62(E-EL-R0016)和ELISA 試劑盒購自Elabscience;注射用鹽酸博萊霉素(每瓶15 mg),日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)(注冊(cè)證號(hào)H20090885);槲皮素購自上海西格瑪(Sigma)公司。 AniRes2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)購自北京貝蘭博科技有限公司;PCR 儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國伯樂公司;Gel View 6000 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司;Multiskan GO酶標(biāo)儀購自Thermo。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模及槲皮素給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組,分別是對(duì)照組10 只、博來霉素組(bleomycin,BLM)20 只、博來霉素+槲皮素組(BLM+QUE)20 只。 大鼠腹腔注射25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉后,BLM 組采取一次性給予大鼠氣管內(nèi)注射BLM(5 mg/kg)以造成大鼠急性肺損傷,對(duì)照組采取一次性氣管內(nèi)注射同體積無菌生理鹽水,BLM+QUE 組采取向氣管內(nèi)一次性注入BLM(5 mg/kg)的當(dāng)日給予腹腔注射槲皮素(3 mg/kg),其后每日一次腹腔注射槲皮素(3 mg/kg),直至大鼠被處死,期間所有大鼠均給予日常飲食。 分別在建模后第7、14、28 天,BLM 組和BLM+QUE 組隨機(jī)處死6 只(剪斷腹主動(dòng)脈處死各組大鼠),并在第28 天處死對(duì)照組6 只,處死前所有動(dòng)物均禁食10 h,稱重后注射25%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉,嚴(yán)格進(jìn)行無菌消毒后留取同一位置適度大小的肺組織,放入凍存管中,置于-80℃冰箱中,用于制備肺組織勻漿和石蠟切片。

1.3.2 HE 染色

將取出的肺組織固定在4%多聚甲醛中24 h,除去多余多聚甲醛,加入PBS,每隔8 h 更換1 次,連續(xù)3 d,4℃冰箱保存,然后切成0.2 cm 厚的小塊并標(biāo)記好,然后用乙醇進(jìn)行梯度洗脫,加入50%乙醇和50%二甲苯靜置30 min,然后放入100%二甲苯,觀察組織塊至透明。 此時(shí)放入已經(jīng)融好的50%石蠟和50%二甲苯溶液30 min,然后放入預(yù)融的100%石蠟兩遍,每次2 h,再放入100%石蠟紙盒內(nèi)凝固,置于4℃冰箱存放,取出,使用切片機(jī)切成約7 μm 厚的切片,將其置于水面上伸展,貼在已經(jīng)處理好的載玻片上。 將制備好的石蠟切片使用二甲苯進(jìn)行脫蠟,酒精梯度水化后用蘇木精染液浸泡8 min后,再用自來水沖洗,加入1%鹽酸乙醇10 s 后自來水沖洗,再加入0.5%伊紅浸染3 min 后自來水沖洗,然后再用梯度乙醇脫水,依次使用二甲苯I 和II透明,中性樹膠封片待分析。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)分析各細(xì)胞因子

使用雙抗體夾心法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)。 以TNF-α 為例:標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書進(jìn)行梯度稀釋,樣本用樣本稀釋液進(jìn)行稀釋,分別于標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、空白孔加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液各100 μL,各孔分別加生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體50 μL,經(jīng)37℃孵育后各孔加350 μL 洗滌液,靜置1 min 后棄去,重復(fù)4 次,各孔加入標(biāo)記的鏈霉親和素工作液100 μL,經(jīng)37℃孵育30 min 后棄去,重復(fù)4 次。 各孔加入100 μL 底物避光孵育,30 min 取出酶標(biāo)板,各孔加入100 μL終止液,450 nm 波長處檢測(cè)OD 值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各細(xì)胞因子的濃度。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)分析

利用Western blot 技術(shù)檢測(cè)在第7、14、28 天時(shí)肺組織的NOX4、P62、NF-κB 水平。 Western blot 技術(shù)主要分以下步驟:提前制備好聚丙烯酰胺凝膠,上樣后進(jìn)行電泳,當(dāng)目的蛋白電泳至分離膠2/3 處時(shí)停止電泳,采用半干式轉(zhuǎn)膜至出現(xiàn)清晰條帶并沖洗至染色液褪去,然后封閉、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜,進(jìn)行顯色反應(yīng)后去除一抗和二抗,然后再洗膜,再次重復(fù)一抗孵育和二抗孵育的過程,最后進(jìn)行圖像分析。

1.3.5 人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

采用含10%胎牛血清的RPMII640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞。 將液氮中凍存的A549細(xì)胞迅速取出后,立即置于37℃的水浴鍋中快速復(fù)蘇,待凍存管內(nèi)液體完全溶解后,轉(zhuǎn)移至離心管中,加入10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻后置于離心機(jī)中離心后倒去上清液,再加入完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中并置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況,當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合或即將匯合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,全部操作步驟在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。 將培養(yǎng)瓶中A549 細(xì)胞用胰酶消化以制備單細(xì)胞懸液,種于培養(yǎng)皿中,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h 后,棄去上清液,用PBS 清洗2 次,加入2%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后換液。 對(duì)照組加入PBS,TGF-β1 組加入終濃度為5 ng/mL 的TGF-β1,TGF-β1+QUE 組加入終濃度為5 ng/mL 的TGF-β1 和100 μmol/L 的QUE,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.6 Real-time PCR 檢測(cè)A549 細(xì)胞中E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA 表達(dá)情況

采用TRIzol 提取試劑盒提取各組A549 細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板,根據(jù)SYBR Green試劑盒中的有關(guān)說明對(duì)E-cadherin 和α-SMA mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),以GAPDH 作為內(nèi)參物。 根據(jù)Primer Prenier 5.0 軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì),引物合成由上海生工生物科技有限公司合成,引物序列見表1。 PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL(其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、7 μL 的ddH2O),PCR 擴(kuò)增條件:94℃ 30 s,63℃ 30 s,72℃ 30 s,60℃ 30 s,共40 個(gè)循環(huán)。 采用2-△△Ct計(jì)算各基因表達(dá)情況。

表1 qRT-PCR 各引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 分析軟件包以及Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組之間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),組內(nèi)數(shù)據(jù)之間的比較采用LSD-t檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織纖維化的形態(tài)學(xué)觀察

建模后第7、14、28 天觀察,對(duì)照組肺表面光滑無結(jié)節(jié)無出血點(diǎn),外觀呈粉紅色,輪廓清晰。 BLM組肺泡在第7 天時(shí)明顯腫脹并有點(diǎn)狀紅斑;第14 天時(shí)呈灰白,有點(diǎn)狀出血;第28 天時(shí)質(zhì)地較硬,體積明顯縮小。 BLM+QUE 組與BLM 組比較,整體情況偏好,沒有明顯結(jié)節(jié),偶見少許點(diǎn)狀出血及斑塊,具體見圖1。

圖1 形態(tài)學(xué)觀察不同組別大鼠第14、28 天肺組織纖維化情況Figure 1 Morphological observation of pulmonary fibrosis in different groups on the 14th and 28th days

2.2 HE 染色檢測(cè)結(jié)果

HE 染色顯示,建模后對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁較薄,肺泡內(nèi)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。 BLM 組肺泡在第7 天時(shí)有大量炎癥細(xì)胞聚集,并有少量膠原纖維;第14 天肺泡間隔顯著增厚,膠原纖維增多;第28 天時(shí)部分肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞,大量肺泡塌陷,出現(xiàn)纖維化區(qū)域。 BLM+QUE 組在第7天時(shí)可見肺泡有炎性細(xì)胞浸潤但較BLM 組癥狀輕;第14 天時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤減輕,有少量膠原纖維沉積;第28 天時(shí)肺組織炎癥病變明顯減輕,輕度肺纖維化得到明顯改變,具體見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織第7、14、28 天的HE 染色情況Figure 2 HE staining of lung tissue of rats in each group on day 7, 14 and 28

2.3 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

在第7、14、28 天的樣本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),BLM 組的TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-8,與對(duì)照組比較明顯上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),給藥第14、28 天的樣本中,BLM+QUE 組的TGFβ1、IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-8,與BLM 組比較顯著下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示槲皮素在一定程度上具有減輕肺組織纖維化大鼠的炎癥反應(yīng),見表2。

表2 各組細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of cytokines in each group

2.4 槲皮素對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

對(duì)照組中A549 細(xì)胞的E-cadherin 呈高表達(dá),α-SMA 呈低表達(dá),加入TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中,在第7、14、28 天時(shí),A549 細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)明顯降低,在第28 天時(shí)達(dá)最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),同時(shí)對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn),α-SMA 的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。 給予槲皮素后,各時(shí)間點(diǎn)與TGF-β1 組比較,A549 細(xì)胞的E-cadherin 的表達(dá)明顯升高(P<0.05),但低于正常對(duì)照組,α-SMA 的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 該結(jié)果說明槲皮素能夠抑制TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞誘導(dǎo)的EMT 的轉(zhuǎn)變,具體見圖3、表3。

表3 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA 的表達(dá)Table 3 Expression of E-cadherin mRNA and α-SMA mRNA in different groups at different time points

圖3 qRT-PCR 檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA 的電泳圖Figure 3 Electrophoresis of E-cadherin mRNA and α-SMA mRNA detected by qRT-PCR at different time points in each group

2.5 NOX4 和P62 蛋白的表達(dá)

在第7、14、28 天的樣本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),BLM 組NOX4、P62、NF-κB 蛋白表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組。 在第7 天檢測(cè)的樣本,BLM+QUE 組與BLM 組比較,NOX4、P62、NF-κB 蛋白表達(dá)量有所降低,但差異不顯著(P>0.05),但在第14、28 天的檢測(cè)結(jié)果中,BLM+QUE 組與BLM 組比較,NOX4、P62、NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05),見圖4、表4。

表4 不同組別不同時(shí)間點(diǎn)NOX4、P62 及NF-κB 的蛋白表達(dá)Table 4 Protein expression of NOX4, P62 and NF-κB at different time points in different groups

圖4 Western blot 檢測(cè)各組大鼠肺組織不同時(shí)間點(diǎn)NOX4、P62 及NF-κB 蛋白表達(dá)電泳圖Figure 4 Western blot detection of NOX4, P62 and NF-κB in lung tissue of rats in each group at different time points

3 討論

肺纖維化的致病因素至今沒有明確闡釋清楚,可能與不斷惡化的空氣質(zhì)量、環(huán)境粉塵污染以及不明原因的物理化學(xué)污染等有關(guān)。 目前臨床上沒有根治的辦法,患者常會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性加重,最終出現(xiàn)呼吸衰竭而死亡。 研究證明中藥能夠通過調(diào)節(jié)TGF-β 信號(hào)通路發(fā)揮抑制肺纖維化的作用[4-5]。 槲皮素在柴胡等中藥中含量較高,具有多種生物學(xué)活性,既往的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)肺部疾病具有一定效果[6-7]。 明確槲皮素在抗肺纖維化過程中的機(jī)制有助于開發(fā)有針對(duì)性的治療藥物。 博萊霉素在Fe2+和O2-存在下誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基,誘發(fā)細(xì)胞膜發(fā)生DNA 解鏈和脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致細(xì)胞受損,啟動(dòng)纖維化前炎癥反應(yīng)[8]。 本次研究采用博萊霉素誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肺纖維化,在造模后第7、14、28 天觀察各組肺組織外觀情況并經(jīng)HE 染色結(jié)果分析,證明博萊霉素可以導(dǎo)致大鼠肺組織發(fā)生纖維化。 本次研究進(jìn)一步探討槲皮素對(duì)大鼠肺纖維化炎癥反應(yīng)的影響。

炎癥反應(yīng)在肺的纖維化過程中發(fā)揮重要作用,由于炎癥細(xì)胞的聚集導(dǎo)致肺泡壁和氣道的受損,繼而出現(xiàn)的纖維化使肺發(fā)生不可逆重建[9-10]。 TGFβ1 是肺纖維化形成的關(guān)鍵因子,它能夠促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)成纖維細(xì)胞的形成。 TNF-α 可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和間質(zhì)細(xì)胞增殖分化。 IL-1β 是一種前炎性因子,能夠誘導(dǎo)其它炎性因子的合成。 肺纖維化的發(fā)生與多種細(xì)胞因子如TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NF-κB 等的異常表達(dá)有一定關(guān)系,已有研究證明TGF-β1、IL-1β 和TNF-α對(duì)于促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生和肺纖維化發(fā)揮重要作用[11]。 本次研究結(jié)果與既往的研究結(jié)果一致[12],發(fā)現(xiàn)在肺纖維化形成過程中,TGF-β1、IL-1β和TNF-α 的表達(dá)明顯上升,給予槲皮素后,3 者水平又明顯下降,說明槲皮素能夠減輕肺纖維化的炎癥反應(yīng)。

成纖維細(xì)胞大量聚集是肺纖維化的重要病理特征,而成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生主要有3 個(gè)途徑,除了肺固有的成纖維細(xì)胞發(fā)生增殖和外周血游離的成纖維細(xì)胞遷移至肺以外,最主要的就是肺上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。 因此,以間質(zhì)轉(zhuǎn)化為研究靶點(diǎn)可能會(huì)抑制肺纖維化的進(jìn)程。 E-cadherin 是上皮細(xì)胞的主要標(biāo)志物之一,在維持細(xì)胞間的正常鏈接中起到重要作用,它的表達(dá)減少會(huì)釋放β-cadherin 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核進(jìn)而誘導(dǎo)間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)。 α-SMA 是平滑肌肌動(dòng)蛋白的一種異構(gòu)形式,主要控制細(xì)胞的收縮,它的表達(dá)是纖維化的標(biāo)志,當(dāng)上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí),α-SMA 的表達(dá)明顯增加,TGF-β1 能夠促進(jìn)α-SMA 的表達(dá)[14]。 本次研究結(jié)果提示:槲皮素能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1 誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞對(duì)E-cadherin 表達(dá)的抑制,同時(shí)能夠下調(diào)發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化后α-SMA 的表達(dá),說明槲皮素能夠抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

氧化抗氧化平衡失調(diào)可能是肺組織纖維化的機(jī)制之一。 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)在生理狀態(tài)下呈低表達(dá)、低活性狀態(tài),當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時(shí),NOX 被激活后通過產(chǎn)生活性氧簇介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與疾病的發(fā)生發(fā)展。 在肝纖維化初始階段,NOX 參與調(diào)控TGF-β 等促纖維化因子作用下細(xì)胞的活化[15]。NOX4 是NOX 的一個(gè)重要亞基,NOX4 誘導(dǎo)老年小鼠NrF2 應(yīng)答的能力損傷,導(dǎo)致肺組織更容易發(fā)生纖維化[16]。 自噬是真核生物中長周期蛋白降解的重要途徑,在細(xì)胞的整個(gè)生命周期中扮演重要角色。自噬蛋白P62(也稱為SQSTM1 蛋白)是檢測(cè)自噬水平的標(biāo)志物,當(dāng)細(xì)胞自噬活性受到抑制時(shí),P62 蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量聚集,引發(fā)一系列生理病理結(jié)果。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOX4 的蛋白表達(dá)隨著肺纖維化的嚴(yán)重程度增加而呈進(jìn)行性升高,證明NOX4 的促纖維化效應(yīng),同時(shí)說明NOX4 不僅參與早期肺細(xì)胞損傷,而且在肺纖維化的形成階段可能發(fā)揮非常重要的作用。 研究結(jié)果中,BLM 組P62 蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組,BLM+QUE 組P62 蛋白表達(dá)較BLM 組明顯降低,說明自噬不足參與了肺纖維化的過程,同時(shí)也證明槲皮素能夠下調(diào)自噬抑制肺纖維化大鼠的P62 蛋白表達(dá),通過抑制NOX4-P62 信號(hào)途徑,激活自噬,干預(yù)肺纖維化,減輕肺纖維化的癥狀。

綜上所述,博萊霉素能夠誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肺纖維化,槲皮素能夠減輕肺纖維化的炎癥反應(yīng),能夠抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,同時(shí)也能通過抑制NOX4-P62 信號(hào)途徑,激活自噬,干預(yù)肺纖維化,減輕肺纖維化的癥狀。但是我們的研究對(duì)象是實(shí)驗(yàn)大鼠,對(duì)于人體肺纖維化的實(shí)際療效到底如何,槲皮素的適宜劑量等方面的情況還需要做進(jìn)一步的研究才能確定。