優(yōu)化選擇性卵裂期單胚胎移植策略的妊娠結(jié)局分析

季玉娟，鄭愛燕，丁潔，蒲艷，許詠樂，王馥新，李惠敏，孟慶霞*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215000；2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，南京 211166)

近30多年來，隨著輔助生殖技術(shù)(ART)的飛速發(fā)展，治療難治性不孕不育癥在技術(shù)方面取得重大突破的同時，多胎妊娠率也明顯升高，高達30%～40%[1]，而自然妊娠中雙胎妊娠發(fā)生率僅為0.01%～2%[2]。多胎妊娠大大增加了孕婦、胎兒、新生兒圍產(chǎn)期疾病和并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險，并使新生兒死亡率、成年后慢性病發(fā)病風(fēng)險增高。有研究顯示，多胎妊娠的早期自然流產(chǎn)率較高，雙胎妊娠為36%，三胎妊娠為53%，四胎妊娠高達65%[3]；且有數(shù)據(jù)顯示我國多胎妊娠的整體早產(chǎn)率從2012年的46.8%上升到了2018年的52.7%[4]。有觀點認(rèn)為ART子代出生缺陷發(fā)生率顯著高于自然妊娠，且缺陷發(fā)生的主要原因是多胎妊娠，多胎妊娠的出生缺陷發(fā)生率是單胎妊娠的兩倍[2]。

ART的多胎妊娠率升高主要是因為多胚胎移植。一些國家規(guī)定移植胚胎數(shù)目不能超過2個，并鼓勵優(yōu)先進行單胚胎移植(SET)[5-8]。2018年中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會(CSRM)發(fā)表了專家共識，建議通過選擇性單胚胎移植(eSET)策略，持續(xù)關(guān)注減少多胎妊娠[9]。ART助孕的理想目標(biāo)是獲得單胎妊娠，其中最重要措施就是減少移植胚胎數(shù)目。eSET從胚胎移植數(shù)目上合理地限制了多胎妊娠的發(fā)生，其被認(rèn)為是解決ART相關(guān)多胎妊娠及母嬰健康問題最根本的措施[9]。因此，本研究回顧性分析我中心通過體外受精后第2天(D2)、D3胚胎形態(tài)學(xué)連續(xù)觀察進行卵裂期選擇性單胚胎移植的臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2019年6月至2020年10月在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心行IVF/ICSI-ET卵裂期胚胎新鮮周期移植或全胚冷凍保存后第1個凍融卵裂期胚胎移植患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者行第1個IVF/ICSI-ET助孕周期，或之前有1次成功助孕經(jīng)歷的患者再次行IVF/ICSI-ET助孕；年齡≥20歲且<35歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18～30 kg/m2；卵巢儲備功能正常[基礎(chǔ)FSH<10 U/L，基礎(chǔ)竇卵泡計數(shù)(AFC)≥9個和/或抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml]；采用降調(diào)節(jié)長方案或拮抗劑方案促排卵；獲得合格卵數(shù)≥6個；均行卵裂期胚胎移植。

排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮畸形和宮腔異常；Ⅲ/Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥；未處理的嚴(yán)重輸卵管積水；卵巢囊腫或一側(cè)卵巢切除；自然流產(chǎn)2次以上(包括生化妊娠)；存在ART及妊娠禁忌證或患有對妊娠有明確影響的疾病。

共納入731個移植周期，根據(jù)患者是否進行D2胚胎形態(tài)學(xué)觀察和胚胎移植數(shù)目分為：D2、D3連續(xù)觀察卵裂期單胚胎移植組(連續(xù)觀察單胚組)70個周期；無D2觀察、僅D3觀察卵裂期單胚胎移植組(D3觀察單胚組)97個周期；僅D3觀察卵裂期雙胚胎移植組(D3觀察DET組)564個周期。

二、研究方法

1.促排卵方案：降調(diào)節(jié)長方案：月經(jīng)第2天給予長效GnRH-a(珠海麗珠)3.75 mg皮下注射，28～40 d后，達降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)(E2≤183.0 pmol/L，LH≤5.0 U/L，竇卵泡直徑4～8 mm)，給予Gn啟動；拮抗劑方案：月經(jīng)第2或第3天查血，行B超檢查后給予Gn啟動，采用靈活方案，最大卵泡達到12～14 mm或者E2水平1 101.0～1 835.0 pmol/L開始添加GnRH-ant(默沙東，美國)，每日250 μg，直至HCG日。HCG日標(biāo)準(zhǔn)：B超提示4枚主導(dǎo)卵泡直徑達到17 mm或3枚主導(dǎo)卵泡直徑達到18 mm。HCG注射后36 h取卵。

2.人工授精、胚胎培養(yǎng)及移植：將獲得的卵丘卵母細胞復(fù)合體(COCs)用G1 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)沖洗3次，置于含G1 plus培養(yǎng)液的胚胎培養(yǎng)皿(BD，美國)于常規(guī)培養(yǎng)箱(K-MING-1000，美國)中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：37℃，6.2%CO2，5%O2)。4～6 h后根據(jù)處理后精子情況行IVF(處理后前向運動精子總數(shù)≥3×106)或ICSI(處理后前向運動精子總數(shù)<3×106)。授精后17～19 h觀察受精情況，將觀察到雙原核(2PN)的正常受精合子放入微滴培養(yǎng)皿獨立培養(yǎng)，每個微滴含25 μl G1 plus培養(yǎng)液，按順序標(biāo)記后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d(培養(yǎng)條件同前)。根據(jù)受精后第2天(D2)上午(受精后41～43 h)和D3上午(受精后64～66 h)胚胎的細胞數(shù)目、碎片數(shù)量和卵裂球均勻度進行胚胎形態(tài)學(xué)評分，D2優(yōu)質(zhì)胚胎指4細胞、碎片程度≤2度(即碎片率5%～20%)，卵裂球均勻度≤2度(即卵裂球體積輕度不均)；D3優(yōu)質(zhì)胚胎指6～10細胞、碎片程度≤2度，卵裂球均勻度≤2度。

連續(xù)觀察單胚組根據(jù)D2和D3胚胎形態(tài)學(xué)評分選擇1枚相對最優(yōu)的卵裂期胚胎移植或者冷凍，具體選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)如果D2和D3均為優(yōu)質(zhì)胚胎，則根據(jù)D3胚胎情況選擇最優(yōu)胚胎，第1個標(biāo)準(zhǔn)是細胞數(shù)，由優(yōu)至劣依次是8、9、10、7、6；第2個標(biāo)準(zhǔn)是卵裂球均勻度，越均勻越優(yōu)；最后是碎片程度，碎片越少越優(yōu)。例如一個8細胞胚胎由優(yōu)至劣的順序是811→821→812→822。(2)如果D2沒有優(yōu)質(zhì)胚胎，而D3有優(yōu)質(zhì)胚胎，則根據(jù)D3胚胎質(zhì)量選擇最優(yōu)胚胎，選擇標(biāo)準(zhǔn)同第一條。(3)如果D2有優(yōu)質(zhì)胚胎，而D3沒有優(yōu)質(zhì)胚胎，則根據(jù)D2胚胎選擇最優(yōu)胚胎，首先考慮4細胞，其次考慮卵裂球均勻度，最后考慮碎片程度；例如一個4細胞胚胎由優(yōu)至劣的順序是411→421→412→422。(4)如果D2和D3均無優(yōu)質(zhì)胚胎，則根據(jù)D3胚胎選擇可移植胚胎，具體如下：①如細胞數(shù)≥10，碎片程度≤2度，卵裂球均勻度≤2度的胚胎，首選細胞數(shù)目，細胞數(shù)目越少越優(yōu)；其次是卵裂球均勻度，越均勻越優(yōu)；最后是碎片程度，越少越優(yōu)。②如細胞數(shù)在6～10之間，碎片程度≤3度(碎片率>20%)，卵裂球均勻度≤2度，首選細胞數(shù)目，由優(yōu)到劣的順序是8、9、10、7、6，其次是卵裂球均勻度，最后是碎片程度。

D3觀察單胚組僅根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)評分選擇1枚相對最優(yōu)質(zhì)的卵裂期胚胎移植或者冷凍。

D3觀察DET組僅根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)評分擇優(yōu)選擇2枚的卵裂期胚胎移植或者冷凍。

每組行胚胎冷凍的條件是：患者有卵巢過度刺激的風(fēng)險；存在不利于移植的內(nèi)膜因素；HCG日孕酮(P)≥4.76 nmol/L。其余胚胎均行體外培養(yǎng)至囊胚后冷凍保存。

3.黃體支持：新鮮周期移植者，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵后次日開始黃體支持：陰道給予雪諾同(默克雪蘭諾，德國)90 mg/d+口服地屈孕酮片(雅培，美國)10 mg，bid。取卵后第6天給予達必佳(輝凌，瑞士)0.1 mg單次皮下注射。

全胚冷凍保存者第1次凍融胚胎移植(FET)在取卵后第2個月經(jīng)周期進行。月經(jīng)周期規(guī)律者采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，在月經(jīng)第11～12天開始陰道超聲監(jiān)測排卵，排卵后次日開始給予HCG(珠海麗珠)2 000 U，隔日注射，共5次，聯(lián)合每晚陰道給予黃體酮軟膠囊(安琪坦，西班牙)200 ng和地屈孕酮片(達芙通，雅培)10 mg，bid，排卵后第3天行FET。月經(jīng)周期不規(guī)律或無排卵者行人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，在月經(jīng)周期第2天開始給予補佳樂(先靈，德國)3 mg，bid，11～12 d陰道超聲評估子宮內(nèi)膜厚度，達到7～8 mm開始行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，陰道給予雪諾同90 mg/d或者黃體酮軟膠囊200 mg，bid，聯(lián)合地屈孕酮片20 mg，bid，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化后第4天行FET。

4.妊娠結(jié)局判斷及隨訪：移植后第14天測血β-HCG，HCG陽性者繼續(xù)維持黃體支持；移植后35 d行B超檢查，見孕囊者確認(rèn)為臨床妊娠。黃體支持至妊娠9～10周，行第2次B超檢查，確定持續(xù)妊娠后停止黃體支持，繼續(xù)隨訪至活產(chǎn)。

5.觀察指標(biāo)：主要觀察指標(biāo)為臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))、種植率(孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù))；次要觀察指標(biāo)為多胎妊娠率(多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))、HCG陽性率(HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)，HCG陽性定義為血HCG>10 U/L)、異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))、早期流產(chǎn)率(孕周<12周的自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))及促排卵和胚胎發(fā)育實驗室指標(biāo)等。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，多組整體比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Kruskal-Wallis單因素方差分析。計數(shù)資料用百分率(%)表示，多組整體比較采用R×C表χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正法。并對妊娠結(jié)局的影響因素進行多因素Logistic回歸分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組患者的一般情況比較

3組患者的年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平、AFC等比較均無顯著性差異(P>0.05)。D3觀察單胚組的AMH水平和男方因素不孕比例顯著低于其他兩組(P<0.05)，繼發(fā)不孕和排卵障礙比例顯著高于其他兩組(P<0.05)；連續(xù)觀察單胚組使用長方案促排卵比例顯著低于D3觀察DET組(P<0.05)；D3觀察DET組盆腔輸卵管因素不孕比例顯著高于其他兩組(P<0.05)(表1)。

表1 各組患者的一般臨床資料比較[M(P25，P75)，%]

續(xù)表

二、3組患者促排卵及胚胎發(fā)育實驗室指標(biāo)比較

3組患者的不同授精方式占比、Gn總量、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平、刺激天數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。D3觀察單胚組的獲卵總數(shù)、成熟卵子數(shù)、2PN受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、成囊胚數(shù)均顯著低于其他兩組(P<0.05)，連續(xù)觀察單胚組的優(yōu)胚數(shù)和成囊胚數(shù)均顯著高于D3觀察DET組(P<0.05)，D3觀察DET組的HCG日E2水平顯著高于D3觀察單胚組(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵和胚胎發(fā)育的實驗室指標(biāo)比較[%，M(P25，P75)]

三、3組患者臨床妊娠結(jié)局比較

D3觀察單胚組的臨床妊娠率、HCG陽性率顯著低于其他兩組(P<0.05)，連續(xù)觀察單胚組的種植率顯著高于其他兩組(P<0.05)；3組間的異位妊娠率、早期流產(chǎn)率無顯著性差異(P>0.05)(表3)。連續(xù)觀察單胚組和D3觀察單胚組均無多胎妊娠發(fā)生，D3觀察DET組的多胎妊娠率為42.37%(161/380)。

表3 各組患者臨床妊娠結(jié)局比較(%)

四、3組患者兩種周期類型的臨床妊娠結(jié)局比較

連續(xù)觀察單胚組中鮮胚移植29個周期，F(xiàn)ET 41個周期；D3觀察單胚組中鮮胚移植56個周期，F(xiàn)ET 41個周期；D3觀察DET組中鮮胚移植189個周期，F(xiàn)ET 375個周期。3組患者新鮮周期的種植率、FET周期的臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05)。D3觀察單胚組新鮮周期的臨床妊娠率顯著低于其他兩組(P<0.05)，連續(xù)觀察單胚組FET周期的種植率顯著高于D3觀察DET組(P<0.05)。D3觀察DET組新鮮周期的多胎妊娠率為40.46%(53/131)，F(xiàn)ET周期的多胎妊娠率為43.37%(108/249)(表4)。

表4 新鮮周期與FET周期的臨床妊娠結(jié)局比較

五、多因素Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

以臨床妊娠率為因變量，納入的混雜因素有AMH、不孕類型、不孕因素、HCG日E2水平、促排卵方案、獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、2PN受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)等，進行多因素Logistic回歸分析顯示，各因素對臨床妊娠率的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表5 多因素Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

討 論

IVF-ET技術(shù)應(yīng)用之初，往往移植多個胚胎以保證一定的臨床妊娠率，從而導(dǎo)致多胎妊娠的大幅增加[10]。多胎妊娠的孕婦容易發(fā)生妊娠高血壓綜合征(簡稱妊高征)、產(chǎn)前子癇、妊娠糖尿病、產(chǎn)后出血等嚴(yán)重并發(fā)癥。葉蓉華等[11]研究了各項并發(fā)癥在雙胎和單胎妊娠兩組中的發(fā)病率，雙胎妊娠組的妊高征(28.6% vs. 9.8%)、產(chǎn)后出血(11.5% vs. 2.0%)、妊娠糖尿病(3.8% vs. 1.0%)的發(fā)生率均顯著高于單胎妊娠組(P<0.05)。李天鳳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雙胎組孕婦妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積綜合征(3.67% vs. 0.84%)和貧血(13.07% vs. 8.99%)的發(fā)病率顯著高于單胎組(P<0.05)。此外，多胎妊娠的高剖宮產(chǎn)率還增加了新生兒的健康風(fēng)險。李天鳳等[12]研究顯示與單胎妊娠相比，雙胎妊娠孕婦及家屬因擔(dān)心自然分娩困難、容易出現(xiàn)并發(fā)癥而選擇剖宮產(chǎn)的比率顯著增加(95.18% vs. 61.80%)，雙胎妊娠組孕周明顯縮短[(34.65±5.13)周vs.(35.80±5.17)周]，新生兒早產(chǎn)率(12.16% vs. 11.27%)和低體重兒發(fā)生率(36.01% vs. 2.11%)顯著增高(P<0.001)。隨著對圍產(chǎn)期并發(fā)癥的深入了解，以及體外胚胎培養(yǎng)及冷凍技術(shù)的不斷進步[13]，國內(nèi)外越來越多的生殖領(lǐng)域?qū)＜页珜?dǎo)通過eSET從源頭上降低多胎妊娠的發(fā)生。既往多個研究也顯示了單胚胎移植的有效性。劉麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，eSET組的臨床妊娠率(50.77% vs. 53.83%)和早期流產(chǎn)率(18.18% vs. 9.48%)與DET組并無顯著性差異(P>0.05)，而多胎妊娠率顯著低于DET組(0% vs.29.86%，P<0.001)。周立花等[15]的研究結(jié)論與劉麗等[14]類似。Pandian等[16]發(fā)現(xiàn)隨著eSET率的增加，多胎出生率呈線性下降，且對臨床妊娠率和活產(chǎn)率基本無影響。本研究結(jié)果顯示對于年齡<35歲、卵巢儲備功能正常的患者進行卵裂期單胚胎移植，如果僅根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)評分選擇胚胎移植(D3觀察單胚組)可以獲得接近50%的臨床妊娠率，早期自然流產(chǎn)率為8.51%；如果再結(jié)合D2胚胎形態(tài)學(xué)評分(連續(xù)觀察單胚組)可以獲得與D3觀察DET組相似的臨床妊娠率(68.57% vs. 67.38%)，且兩組的早期自然流產(chǎn)率亦無顯著性差異(4.17% vs. 9.21%)。

D3胚胎評分僅反映了受精后65～67 h觀察點的胚胎發(fā)育情況，若僅觀察D3胚胎，會丟失在此之前很長一段時間內(nèi)的胚胎發(fā)育信息。近年來，關(guān)于胚胎動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，早期胚胎發(fā)育過程中胚胎的細胞分裂時間點、細胞周期間隔時間和細胞分裂同步性，以及胚胎的直接分裂(AC)等都是關(guān)乎胚胎質(zhì)量的重要參數(shù)[17-19]。本中心鄭愛燕等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在D3形態(tài)學(xué)評分優(yōu)質(zhì)的胚胎中，最終形成可用囊胚的胚胎和廢棄胚胎的2細胞和5細胞分裂時間、2細胞發(fā)育到3細胞的時間(CC2)、3細胞發(fā)育成4細胞的時間(S2)均存在顯著性差異(P<0.05)，形成囊胚的D3優(yōu)質(zhì)胚胎和未形成囊胚的D3優(yōu)質(zhì)胚胎到達5細胞分裂時間分別為(46.4±8.0) h和(43.1±8.3) h。提示2細胞到5細胞這段時間是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時期，因此增加D2胚胎形態(tài)學(xué)觀察可以給優(yōu)選胚胎帶來更多有價值的信息。本研究中D2胚胎觀察時間點為受精后41～43 h，據(jù)此推測該時間點發(fā)育到4細胞的胚胎形成囊胚率高于發(fā)育到4細胞以上的胚胎；而D2胚胎細胞數(shù)不足4細胞時，說明胚胎發(fā)育緩慢，潛能不足。魏玉蘭等[21]研究發(fā)現(xiàn)D2的2細胞和3細胞胚胎，其臨床妊娠率均顯著低于4細胞胚胎。可見D2胚胎發(fā)育過慢或者過快都會影響胚胎發(fā)育的能力，D2胚胎形態(tài)學(xué)評分是評估胚胎發(fā)育潛能的一個重要指標(biāo)。因此，D2、D3連續(xù)胚胎評分能夠提供胚胎發(fā)育過程中更多的胚胎發(fā)育信息，比單純D3觀察更有利于篩選最優(yōu)質(zhì)胚胎。

本研究中兩個eSET組均無多胎妊娠發(fā)生，而D3觀察DET組的多胎妊娠率高達42.37%。據(jù)文獻報道雙胎妊娠的剖宮產(chǎn)率高達75%[22]。剖宮產(chǎn)后由于疤痕處肌層纖維薄弱，孕囊可能植入其中生長，瘢痕子宮再次妊娠時容易發(fā)生前置胎盤、胎盤植入、子宮破裂、產(chǎn)后出血和早產(chǎn)等嚴(yán)重并發(fā)癥[23-26]。隨著生育政策調(diào)整和生育年齡延遲，選擇生育多孩和高齡女性生育的情況越來越多，因此，為了母嬰健康和社會效益，進行eSET以避免醫(yī)源性多胎妊娠和高剖宮產(chǎn)率顯得尤為必要。本研究的不足之處是觀察的終點是臨床妊娠率，后續(xù)將繼續(xù)隨訪，收集活產(chǎn)率、早產(chǎn)率及圍產(chǎn)期并發(fā)癥等相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析；本研究為回顧性分析，組間樣本量差異較大，雖然采用了非參數(shù)秩和檢驗對觀察指標(biāo)評估的影響不大，但仍需擴大樣本量后進行匹配性研究；另外，因本研究排除了獲卵數(shù)少的患者，且只統(tǒng)計了此次取卵的首次移植周期結(jié)局，因此Logistic回歸分析中各因素對臨床妊娠率的影響并不明顯。

綜上所述，對于年齡<35歲、卵巢儲備功能正常的患者進行D2、D3連續(xù)胚胎形態(tài)學(xué)觀察后行卵裂期eSET是可行的優(yōu)化移植策略，可獲得較理想的臨床妊娠率，降低多胎妊娠率；同時減少了因胚胎體外培養(yǎng)帶來的潛在風(fēng)險，有利于改善妊娠結(jié)局。