時差成像系統對IVF/ICSI周期胚胎發育及移植結局的影響

喬靜，馮玲，顏秋霞，周秀琴，朱振杰，張國志，陳彩蓉

(廣州醫科大學附屬第六醫院，清遠市人民醫院生殖醫學中心，清遠 511520)

胚胎選擇是體外受精過程中進行胚胎移植的關鍵因素，相當一部分患者的胚胎移植入子宮后并不能著床[1]。近年來國際會議上對單胚胎移植的呼聲越來越高，故而胚胎優選環節相當重要。體外受精中最常用的胚胎選擇方法是胚胎的形態分級[2]。然而，這種方法需要在特定的時間點將胚胎移出培養箱在顯微鏡下觀察胚胎，胚胎學家可獲得的信息相對有限；而且將胚胎移入和移出培養箱存在安全隱患及培養環境改變影響培養體系的穩定，從而影響胚胎發育。

隨著IVF中時差成像(Time-lapse imaging，TLI)技術的引入，通過在確定的間隔和焦平面捕捉圖像來連續監測胚胎發育成為可能[3]。TLI的優點之一是能夠在不干擾培養條件的情況下實時觀察胚胎[4]，并提供了一種無創的方法來識別具有最高植入潛能的胚胎。自從這項技術投入使用以來，可以通過TLI識別與相關形態動力學參數預測胚胎發育和臨床結局。然而，關于其在臨床上的應用意義并未達成普遍共識。

本研究通過比較本中心TLI培養與常規培養的胚胎發育情況和妊娠結局，探討TLI的臨床應用價值，以期為TLI技術挑選胚胎移植提供參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2020年12月在我中心行體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)并選擇新鮮周期移植的510例患者的510個周期的臨床資料。其中使用TLI系統培養胚胎的166個周期為TLI組，使用常規培養胚胎的344個周期為常規組。

納入標準：女方年齡<40歲，因輸卵管堵塞和卵巢高反應或男方因素(重度少、弱、畸精子癥，梗阻性無精子癥，性功能障礙等)接受輔助生殖治療；促排卵方案主要為改良長方案或拮抗劑方案；IVF/ICSI周期；首次行輔助生殖技術助孕，新鮮周期卵裂胚移植。

排除標準：獲卵數≤3個；合并子宮內膜息肉、子宮肌瘤、輸卵管積水、子宮畸形(如縱隔子宮)、宮腔粘連、子宮內膜異位癥、巧克力囊腫、復發性流產等；夫妻雙方染色體異常，或患有遺傳性疾病；合并自身代謝性疾病，如糖尿病、高血壓、甲狀腺相關疾病等；基礎資料收集不全；男方無精子癥、睪丸發育不良、泌尿生殖系統炎癥。

二、診療回顧

1.取卵及人工授精：患者進行改良長方案或拮抗劑方案促排卵。當女方有2個或2個以上卵泡直徑≥18～20 mm時，肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)，34～36 h后經陰道超聲引導下穿刺取卵，記錄獲卵數。男方在女方取卵日當天取精，精子和卵子在體外結合16～18 h后脫顆粒，或直接將卵子脫顆粒后行ICSI。所有患者在選擇胚胎培養方式(常規培養、TLI系統培養)時，均在醫生告知情況后自愿做出決定，并簽署胚胎培養知情同意書。

2.胚胎培養：受精后的2PN胚胎轉入含G-1培養液(Vitrolife，瑞典)的培養皿。常規組放入普通培養箱(Labotech C60，德國)，培養環境為6.0%CO2、5%O2、37℃；TLI組放入Embryoslid培養皿，置于Embryo Scope時差培養箱(Vitrolife，瑞典)，培養箱環境6.0%CO2、5%O2、37℃。胚胎培養至第3天時，挑選優質胚胎進行新鮮移植或者冷凍，剩余胚胎換液繼續培養至第5或第6天，常規組胚胎更換至含G-2培養液(Vitrolife，瑞典)的培養皿；TLI組暫停拍照，取出培養皿，將G-1培養液吸出，盡快換成G-2培養液，再次放入TLI系統中培養。設置拍照時間間隔為1次/10 min和每小時7個等距的焦平面掃描，連續拍攝3～6 d。

3.胚胎評分和移植：常規組根據傳統胚胎評分方法(根據卵裂球分裂數目、卵裂球大小、均一度及碎片率)對胚胎進行評級，本中心的優質胚胎定義為第3天卵裂球數目7～9個、卵裂球均一且碎片率≤20%。而TLI組則根據標記胚胎發育的各個關鍵時間點結合胚胎發育動力學以及胚胎形態學優選胚胎。每組根據各患者的具體情況，選擇1～2枚優質卵裂期胚胎進行新鮮周期移植。TLI組移植前需回看胚胎發育過程選擇優質胚胎，排除直接卵裂、逆卵裂、多核等異常發育來源的胚胎；剩余胚胎繼續囊胚培養。囊胚評分采用Gardner評分系統，根據囊胚的擴張和孵出程度將其分為1～6期，對3～6期的囊胚進一步評價內細胞團(ICM)和滋養層細胞(TE)質量。本中心定義3BC及以上的囊胚為可利用囊胚，≥3BB者為優質囊胚。

4.臨床結局評價：移植后14 d測β-HCG，陽性者于4～6周B超檢查見孕囊者為臨床妊娠。

三、觀察分析指標

患者一般資料，包括年齡、體質量指數(BMI)、基礎激素水平、不孕相關資料等；促排卵資料，包括Gn用量、獲卵數等；受精及胚胎培養資料，包括受精結局和胚胎質量評估；新鮮周期移植結局，包括移植胚胎數量及質量、移植日內膜厚度、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、雙胎率等。臨床妊娠率和種植率以胚胎移植后第5周超聲檢查探及宮內孕囊為標準。

四、統計學分析

結 果

一、兩組患者的一般資料及促排卵情況比較

本研究共納入510例患者的510個周期，其中常規組344個周期、TLI組166個周期。兩組患者的女方BMI、不孕年限、基礎FSH水平、原發性不孕占比、Gn總量、獲卵數比較均無顯著性差異(P>0.05)，而TLI組的女方年齡顯著小于常規組，獲卵數顯著高于常規組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料及促排卵情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者間胚胎發育情況比較

TLI組的正常受精率顯著高于常規組(P<0.001)，且囊胚形成率、可利用囊胚率與優質囊胚率均顯著高于常規組(P<0.05)；其它的相關評價指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間胚胎發育情況比較(%)

三、兩組患者間新鮮周期移植結局比較

TLI組平均移植胚胎數顯著少于常規組(P<0.05)；TLI組胚胎種植率、臨床妊娠率及流產率均略高于常規組，雙胎率略低于常規組，但均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組間新鮮移植周期臨床結局比較[(-±s)，%]

四、基于傾向性得分評分匹配后的結果

考慮到基線數據包括年齡、獲卵數兩組不均衡，本研究進一步對數據進行傾向性得分評分匹配，比例為1∶1，最終得到常規組和TLI組各164例。

兩組患者間基線資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表4-1)。相關結局與未匹配前基本一致，TLI組正常受精率、囊胚形成率、可利用囊胚率、優質囊胚率均顯著優于常規組(P<0.05)(表4-2)；TLI組移植胚胎數顯著低于常規組(P<0.05)，而組間胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率、雙胎率均無顯著性差異(P>0.05)(表4-3)。

表4-1 傾向性匹配后兩組間基礎資料比較[(-±s)，%]

表4-2 傾向性匹配后兩組間胚胎發育情況比較(%)

表4-3 傾向性匹配后兩組間新鮮移植周期臨床結局比較[(-±s)，%]

討 論

TLI作為新的胚胎培養及觀察系統，根據其提供的完整胚胎動力學參數，可觀察到胚胎發育的異常事件，為胚胎學家挑選胚胎提供有利的依據。因此，TLI系統也越來越廣泛地應用于各大生殖中心實驗室，用于卵裂期胚胎的培養與選擇。

本研究發現，通過TLI系統培養的胚胎其正常受精率要比常規培養組高。伊斯坦布爾共識認為精卵結合后原核將在(17±1)h時間段出現[5]，但少部分胚胎可能會發生原核早消失或者晚發生事件[6]。而我中心常規培養的胚胎一般在受精18～19 h左右拿出培養箱在顯微鏡下觀察，因此有時會錯過原核觀察的時間；而TLI系統可以實時監控原核的發生及消失，并以每10 min拍攝1次的頻率和每小時7個等距的焦平面掃描，減少了漏檢的幾率，因此，TLI系統培養較常規培養有更高的正常受精率。

胚胎正常的卵裂過程可能與正常的細胞骨架功能、誘發卵母細胞受精的激活事件(如鈣離子振蕩)、線粒體功能以及高質量染色體有關[7-8]。這幾個因素可以在卵裂異常的發生中起作用，延遲和異常的分裂模式可能表明DNA損傷或染色體分離錯誤，這些錯誤可以激活一些細胞周期檢查點，阻止細胞周期進程，甚至導致非整倍體發生。有研究發現，通過TLI系統觀察到異常卵裂的胚胎行囊胚培養后，其囊胚形成率及優質囊胚率均低于正常卵裂的胚胎[4，7-9]；通過TLI的計算機自動細胞追蹤軟件結合形態學評估，可顯著提高囊胚期的胚胎發育能力[從(18.3±23.3)%提高到(68.2±1.7)%，P<0.05][2，10]。但2020年高洋等[11]研究表明，使用TLI系統培養的D3胚胎的可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率及優質囊胚率與常規培養相比較并無顯著性差異(P>0.05)。本研究發現，與常規組相比較，TLI組卵母細胞利用率及D3優質胚胎率并沒有提高，但囊胚形成率、可利用囊胚率和優質囊胚率均顯著改善(P<0.05)；且考慮到年齡、獲卵數在兩組間的不均衡，進一步通過傾向性得分評分匹配后，仍得到相同的結論。分析認為在常規培養中，一些被評為1、2級的優質胚胎，使用TLI系統有可能觀察到這些胚胎發生了卵裂扭轉、細胞直接卵裂、逆向卵裂及多核現象等，從而把它們歸為非優質胚胎，這有可能是本研究中TLI組D3優質胚胎率與常規組相比沒有提高的原因，而這些發育異常的胚胎有可能培養成很好的囊胚；此外TLI系統無干擾的培養環境保證獲取圖像信息的同時不造成培養環境波動[12]，有助于胚胎的發育，這可能也是本次研究中TLI組的囊胚形成率、可用囊胚率和優質囊胚率比常規組高的原因。

有研究認為，發生多核的胚胎可能是由于染色體畸變或發生嵌合造成的，而多核發生在4細胞期或同時發生在2細胞與4細胞時期，可能會降低患者的臨床妊娠率和著床率[3，13]。Ergin等[3]表明，胚胎發生異常第一次胞質分裂、異常分裂和無序卵裂等現象，其胚胎后期發育潛能明顯低于正常分裂的胚胎。一項使用不同方法的薈萃分析表明，與傳統的孵育和評估相比，通過TLI優選胚胎，避免了異常卵裂胚胎被移植，妊娠結局有所改善，顯著增高了持續妊娠率，降低了早期妊娠損失[4]。2019年的一篇綜述對9項隨機對照試驗、2 955名婦女進行總結，認為沒有足夠的證據表明TLI結合胚胎選擇軟件優選胚胎，比傳統孵育和評估優選胚胎在活產率、流產率或臨床妊娠率方面存在顯著差異[14]。Meseguer等[15]在一項對1 882個周期的回顧性研究中比較了TLI系統和常規胚胎培養的累積活產率，該研究顯示兩者的累積活產率相似[15]。因此，TLI系統在改善臨床結局這一方面依舊存在爭議。然而在本次研究中我們發現，新鮮胚胎移植周期中，TLI組在平均胚胎移植個數顯著少于常規組的情況下，臨床妊娠率有增長的趨勢(57.22% vs. 51.16%；傾向性匹配后57.32% vs. 54.88%)，雙胎率有降低趨勢(21.05% vs. 24.43%；傾向性匹配后21.28% vs. 25.56%)，雖然尚無統計差異(P>0.05)，但這在某種程度上說明正是因為使用TLI系統讓胚胎在穩定的環境中培養，避免胚胎暴露在非生理條件下，如pH和溫度變化或氣體(CO2和O2)濃度改變，減少了胚胎產生物理和化學應激反應的風險[16]；且TLI系統讓我們連續地觀察到胚胎發育的全過程，從而可以更好、更精準地選擇胚胎移植，在減少移植胚胎個數的基礎上并未影響臨床結局，減低了雙胚移植帶來的多胎妊娠風險，為臨床實行單胚胎移植提供了很好的參考依據。

綜上所述，TLI系統作為新型胚胎培養體系，比常規培養更加便捷與穩定，并且提高了正常受精率、可利用囊胚率及優質囊胚率，更有利于挑選優質胚胎進行臨床移植；雖現有數據顯示TLI系統對臨床結局的改善并不顯著，但隨著TLI系統的普及，可通過多中心前瞻性大數據研究進一步論證其對臨床結局的影響。