不同內膜準備方案對凍融單囊胚移植流產率的影響

苗菁菁，師娟子，薛俠，蔡賀*

(1.西安醫學院，西安 710021；2.西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710000)

自1985年人類第1例凍融胚胎移植(FET)嬰兒誕生以來，FET技術發展迅速，尤其是伴隨選擇性單胚胎移植政策的推廣，同周期剩余胚胎得以凍存。根據我國國家衛生健康委數據顯示，2016年FET周期占全年輔助生殖周期的40.5%[1]，提示FET技術已經成為輔助生殖技術(ART)的重要組成部分[2-3]。不孕癥患者接受ART治療后自然流產率約為20%，其中有50%為生化妊娠[4-5]。自然流產的發生不僅降低了ART的活產率，還給不孕癥夫婦帶來負面情緒。然而自然流產原因復雜，與激素水平、年齡、胚胎質量以及環境等諸多因素相關。有研究表明，外源性激素的暴露可能不利于胚胎-子宮內膜同步性的建立和后續妊娠結局[6-7]。人工周期和自然周期是FET最常用的兩種內膜準備方案，目前尚無充分證據表明哪種方案更優[8-9]。因此，本研究擬分析人工周期和自然周期中的自然流產率(包括生化妊娠率及臨床流產率)及其影響因素，為提高FET周期活產率、找尋最佳的內膜準備方案提供證據。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2015年1月至2020年12月在西北婦女兒童醫院生殖中心行凍融單囊胚移植(FBT)后血清絨毛膜促性腺激素(HCG)≥10 U/L患者的臨床資料。

納入標準：(1)單囊胚移植周期；(2)孕酮(P)轉化日子宮內膜厚度≥7 mm。排除標準：(1)受卵/供精周期；(2)夫妻雙方存在一方染色體異常；(3)合并輸卵管積水；(4)存在復發性流產。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準(批準號2019013)。

本研究共納入2 935例患者(共3 099個周期)。根據FET周期不同子宮內膜準備方案分為人工周期組(AC組，2 615個周期)和自然周期組(NC組，484個周期)。

二、研究方法

1.FET內膜準備：AC組：從月經周期第5天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)2 mg，3次/d，連用5 d，然后根據陰道超聲檢查結果調整用量；當雌激素用藥時間≥8 d、子宮內膜厚度≥8 mm時，給予陰道黃體酮軟膠囊(安琪坦，博賞，法國)600 mg/d轉化內膜，黃體酮用藥的第7日移植凍融囊胚。NC組：從月經周期第8～10天開始，通過陰道超聲監測卵泡生長情況并監測血清黃體生成素(LH)水平；當卵泡直徑≥18 mm時，檢測LH、雌二醇(E2)及P水平，根據LH峰出現時間或卵泡消失時間確定FET時間，卵泡消失的第6天移植凍融囊胚。

2.黃體支持方案：采用我中心常規黃體支持方案[10]進行黃體支持，即地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)口服30 mg/d+黃體酮凝膠(雪諾同，Fleet Laboratoires Ltd，英國)1.125 g/d陰道置入或黃體酮軟膠囊600 mg/d陰道置入。

3.囊胚形態評分：按Gardner分級標準[11-12]對所形成的囊胚進行評分。根據囊胚的擴張和孵出程度將囊胚分為6級：1級：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎體積的1/2；2級：囊胚腔超過胚胎體積的一半；3級：完全囊胚，囊胚腔充滿整個胚胎；4級：擴張期囊胚，囊胚腔擴張，直徑大于最初的胚胎直徑，透明帶變薄；5級：正孵出囊胚，即胚胎正從透明帶中孵出；6級：已孵出的囊胚，囊胚完全從透明帶中孵出。根據內細胞團(ICM)和滋養外胚層(TE)細胞的發育情況進行質量評級，ICM評分：A級：細胞數目多，結合緊密；B級：細胞數目較少，結合較松散；C級：細胞數目極少。TE評分：A級：細胞數目多，囊胚四周均有細胞分布；B級：細胞數目較少，上皮細胞較松散；C級：細胞數目極少。3級及以上且ICM評分及TE評分均≥C級定義為可用囊胚，其中ICM評分及TE評分均≥B級以上定義為優質囊胚。

4.觀察指標：觀察兩組患者的臨床妊娠率、生化妊娠率、臨床流產率及活產率。臨床妊娠指移植30 d后超聲檢查宮內可見孕囊；生化妊娠指超聲可見孕囊前血HCG下降且<7 U/L；臨床流產指確認妊娠囊出現后檢測到的完全流產或超聲提示胎心搏動消失；活產指胎齡≥28周的活胎分娩。

三、統計學分析

結 果

一、兩組患者一般資料比較

本研究共納入3 099個FBT周期，其中AC組2 615個周期，NC組484個周期。兩組患者的一般資料比較，AC組的平均年齡顯著低于NC組(P<0.01)；AC組ICM評級為A、B級的周期比例顯著高于NC組(P<0.05)，而ICM評級為C級的周期比例顯著低于NC組(P<0.05)；NC組TE評級為A、B級的周期比例顯著低于AC組(P<0.01)，TE評級為C級的周期比例顯著高于AC組(P<0.01)。兩組患者的體質量指數(BMI)、既往妊娠情況、移植日子宮內膜厚度以及移植不同形成天數(第5天或第6天)囊胚的比例均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較[(-±s)，n(%)]

續表

二、兩組患者的妊娠結局比較

AC組患者的生化妊娠率、臨床流產率均略大于NC組，但差異均無統計學意義(P>0.05)；AC組的活產率則顯著低于NC組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的妊娠結局比較(%)

三、兩組患者臨床結局的GEE回歸分析

采用GEE多元回歸模型對患者年齡、既往孕產史及囊胚形態學評級等混雜因素進行調整后，AC組和NC組生化妊娠率相似[aOR=1.43，95%CI(0.96，2.12)，P=0.08](表3)，而AC組的臨床流產率顯著高于NC組[aOR=1.42，95%CI(1.08，1.87)，P=0.01](表4)。

表3 兩組患者生化妊娠率的GEE回歸分析

FBT周期的生化妊娠率和囊胚形態學參數中的ICM分級相關，ICM評級C級的生化妊娠風險顯著高于ICM評級A級[aOR=2.31,95%CI(1.26，4.22)，P=0.01](表3)。除了內膜準備方案外，年齡也是影響臨床流產率的因素，女性年齡增加，臨床流產率顯著增加[aOR=1.06，95%CI(1.04，1.09)，P<0.01](表4)。

表4 兩組患者臨床流產率的GEE回歸分析

四、敏感性分析

使用GEE模型，進一步排除月經周期不規律的女性患者后，妊娠結局無明顯變化。

討 論

ART助孕的生化妊娠和臨床流產是影響活產率的重要因素，給不孕不育夫婦帶來心理、生理、經濟的多重壓力，如何降低自然流產率是臨床醫生和患者所關注的問題。本研究比較了FBT周期中不同內膜準備方案對自然流產率(包括生化妊娠率及臨床流產率)的影響，結果表明：人工周期不增加FBT后的生化妊娠率，但是可能和臨床流產率升高相關。多因素回歸模型表明，囊胚形態學參數中的ICM分級低增加FBT后生化妊娠風險；除內膜準備方案以外，年齡是影響FBT周期臨床流產率的重要因素。

本中心既往的一項回顧性研究發現，對于月經規律的女性，FET周期中人工周期準備內膜的活產率顯著低于自然周期[10]。與既往研究結果一致，本研究中雖然AC組女性較NC組更年輕(平均年齡及≥35歲高齡女性比例均顯著低于NC組)，然而AC組臨床流產率卻略高于NC組。并且GEE多元回歸分析也支持AC組臨床流產率顯著高于NC組[OR=1.42，95%CI(1.08，1.87)，P=0.01]，進一步證實FBT周期中使用的內膜準備方案可能會影響臨床流產率[14-15]。Tomás等[14]分析了5年共4 470個FET周期，發現人工周期準備內膜的臨床流產率顯著高于自然周期(22.4% vs.13.6%，P<0.05)，與本研究結果相似。人工周期增加自然流產風險的機制并不完全清楚，有研究認為與激素使用后提高血栓栓塞風險、損害胎盤功能進而導致流產有關[11，16]。除了內膜準備方案以外，女性年齡也是影響臨床流產率重要因素。本研究中，高齡女性的臨床流產率顯著增加[aOR=1.06，95%CI(1.04，1.09)，P<0.01]。隨著年齡的增長，女性卵巢功能減退，胚胎非整倍體率增加，是臨床妊娠率下降和流產率增加的重要原因。本研究中，AC組患者的平均年齡顯著小于NC組(P<0.05)，盡管多元回歸分析時調整了年齡因素，但仍不能排除年齡差異的影響。

本研究首次將生化妊娠率納入主要研究結果的分析。與臨床流產率的影響因素不同，不同內膜準備方案(P=0.08)和女性年齡(P=0.87)均不影響FBT周期生化妊娠風險。此結果提示，生化妊娠與臨床流產發生的機制可能存在差異。Dahan等[17]研究女性年齡對新鮮或凍融周期生化妊娠的影響發現，女性年齡不影響生化妊娠率。IVF治療周期是研究臨床前流產的理想路徑。一般胚胎發育17 d時可通過早期血β-HCG定量檢測出妊娠。本研究的生化妊娠率在AC組為8.45%，在NC組為6.40%，與已發表文獻[18]中的生化妊娠數據大致一致。Zeadna等[18]研究認為，FET并不增加生化妊娠風險，但是移植胚胎的質量和發育階段是發生生化妊娠的影響因素。而Vaiarelli等[19]認為生化妊娠率與移植時胚胎發育階段和染色體均無關。囊胚形態學評分是目前臨床常用的評價囊胚質量的方案，有研究認為囊胚ICM分級高與臨床妊娠率呈正相關[20-22]，但是囊胚形態學參數與早期妊娠丟失相關研究文獻很少。我們觀察到移植ICM分級較低的囊胚后生化妊娠的風險增加，移植ICM評級C級的囊胚發生生化妊娠的風險高于ICM評級A級囊胚，且差異有統計學意義[95%CI(1.26，4.22)，P<0.01]。但考慮到回顧性研究的不足，未來仍需更多大樣本量前瞻性研究的證據進一步證實。

本研究仍存在以下不足：(1)作為回顧性研究存在較多的混雜因素，但本研究來自臨床真實數據，樣本量較大，且通過GEE多因素模型和敏感性分析，進一步減少潛在影響；(2)囊胚形態學參數評估存在一定主觀性[23]，但本研究為單中心研究，評價指標一致性較好，考慮到現有研究設計的局限性，未來還需臨床前瞻隨機對照試驗的結果來指導臨床實踐；(3)AC組與NC組樣本量差異較大，主要原因是AC組準備內膜相對容易，取消率低，尤其是對于外地患者，簡便易行。經過本研究回顧性地分析總結，中心已經更改了FET周期內膜準備方案的標準化作業程序，盡量行自然周期FET。

綜上所述，FBT人工周期內膜準備方案雖然不增加生化妊娠率，但是可能和臨床流產率升高有關。而囊胚ICM分級和年齡也是自然流產率的影響因素。流產給女性的身體和心理都帶來創傷，尤其對于借助IVF-ET成功妊娠的夫婦來說更為不幸。本研究結果有助于為臨床提供最佳的內膜準備方案并為FBT前患者咨詢提供幫助。此外生化妊娠和臨床流產發生的機制可能有所差異，需要更多的研究加以證實。